Differentiellt antal leukocyter och covid-19 diagnos

Introduktion. Den 3 juni 2020 startade den italienska regeringen den så kallade "fas 2", som inkluderade återöppning av arbets- och sociala aktiviteter. Inom denna ram har frågan om hur man identifierar de asymtomatiska individer som omedvetet kan sprida SARS-CoV-2-infektion och utgör ett hot mot folkhälsan tagits upp över hela världen. Den globala befolkningen upplever nu fas 3 av pandemin med en snabb ökning av smittspridningen och uppkomsten av nya fall. Det är nu absolut nödvändigt att garantera hälsan och säkerheten för de personer som kallas tillbaka till arbetet och att skapa ett säkerhetsprotokoll i kommersiella och möteslokaler, vilket innebär att förhindra att smittade människor orsakar nya epidemiutbrott. För detta ändamål krävs ett väletablerat massscreeningsprogram för att tillgodose flera behov: för det första ska det ge resultatet på några minuter, det ska enkelt levereras på territoriet, icke-medicinsk vårdpersonal ska utföra det på ett enkelt sätt sätt också, och bör vara icke-invasiv, repeterbar och pålitlig.

Hittills har diagnosen SARS-CoV-2-infektion ställts genom att identifiera det virala RNA:t i prover som samlats in genom en nasofaryngeal pinne eller andra andningsprover. Denna teknik har dock flera begränsningar för dess tillämpning i en massscreening, bland vilka de viktigaste är den tid som krävs för diagnosen, trängseln av de centra som utsetts för att analysera proverna och den icke försumbara risken för virusöverföring till vårdpersonalen.

Point-of-care testning med snabba handläggningstider skulle möjliggöra mer effektiv triage i miljöer där patienthantering och infektionskontrollbeslut måste fattas snabbt.

Nyligen har det utvecklats en ny metod för att frikänna förekomsten av allvarlig Sar-COV-2-infektion och resulterande covid-19, för att upptäcka den tidiga ökningen av leukocytnivåer som har en karakteristisk uppsättning förhållanden av leukocyttyper, som identifierar den virala patogenen och särskilja den från ett antal andra. Detta test gör det möjligt att förutsäga positiva resultat från fullblodsresultat, känsliga upp till 14 dagar tidigare än kvantitativ PCR i realtid (RT-qPCR), till en kostnad som är minst en storleksordning lägre än andra tester som RT-qPCR och antikropp tester.

Syfte med studien. Det primära syftet med studien med diagnostisk noggrannhet är att validera användningen av den punkt-of-care-karakteristiska Differential Leucocyte Count (CLDC)-enheten och algoritmen för att detektera SARS-CoV-2-infektion hos både symtomatiska och asymtomatiska individer som en preliminär metod för en massa screeningprogram. Jämförelsen representeras av molekylära tester med nasofaryngeal pinnprover, guldstandarden för COVID-19-diagnos, för algoritmvalidering och hematologiska cytometriska analyser av Coulter HMX, Beckman Coulter, för enhetsvalidering.

Sekundära syften är att definiera om CLCD-metoder kan upptäcka SARS-CoV-2-infektion tidigare jämfört med molekylära provtagningar och att utföra en kontaktspårningsstudie på alla dubbelpositiva patienter för att uppskatta deras ursprungliga infektionsdatum för att bestämma kurvan för testa känslighet mot initial infektion.

Metoder. Försökspersoner som genomgår en nasofaryngeal pinnprocedur för diagnos av SARS-CoV-2-infektion kommer att rekryteras i följd vid Clinic Laboratory of IRCCS Neuromed i Pozzilli och Diagnostica Medica Spa i Avellino, Italien. Försökspersoner med låg och hög risk för Sar-Cov-2-infektion kommer att testas: sjukvårdspersonal, patienter som ska läggas in på sjukhus av andra skäl än covid-19 eller annan infektionssjukdom, personer som haft direktkontakt med infekterade patienter.

Samtidigt med nasofarynxprovet på morgonen kommer varje rekryterad försöksperson också att testas med CLDC-enhet och algoritm (CLCD 2). På frivillig basis kommer försökspersonerna också att genomgå blodtappning (3 ml) för hematologiska cytometriska analyser av Coulter HMX, Beckman Coulter och kommer att testas med endast CLDC-algoritm (CLCD 1).

Resultatbedömarna är blinda eftersom resultaten av rRT-PCR-analysen kräver minst 6 timmar innan de är tillgängliga. Forskningspersonal kommer att administrera ett frågeformulär om covid 19-symtom och riskfaktorer och för kontaktspårning (dag, läge) Försökspersoner som testar positivt på något av CLDC-testet men negativt vid pinnprovet kommer frivilligt att genomgå nya pinnprov efter två, 5 och eventuellt 8 dagar om det fortfarande är negativt.

Oberoende blindade läkare genom realtidsomvänd transkription (rRT)-PCR kommer att analysera nasofarynxprovet i enlighet med de internationella riktlinjerna.

För enhetsvalidering kommer Full Blood Count (FBC) att analyseras både genom mätning av Full Blood Count och inmatning av resultaten i Medichain CLDC-1-portalen för snabb analys och genom point-of-care-enheten som är ansluten till smarttelefonen (den Medichain CLDC-2 smartphonemikroskop - Adstock-testet).

Medichain CLDC-2-smarttelefonmikroskopet, en enhet som fästs på en standardsmarttelefon kommer att användas för att analysera bloddroppar på cirka 1 µl utsmetade på ett objektglas (version 2 - Adstock Test) upplyst i faskontrastläge. Bilder kommer sedan att skickas från enheterna till Medichain för analys på servrar i Storbritannien och manuell korskontroll.

Sedan analyserar en förberedande algoritm Athena S3ER som kan mäta indataspecifika FBC-parametrar data från detta resultat och returnerar en utdata; med hänsyn till onormal förekomst i antal specifika FBC-parametrar vid början av infektion. Den grundläggande testportalen för denna studie (känd som S3ER-algoritmen) skulle vara på http://cldc.medichain.online. Den föredragna utökade portalen är forskningsportalen på http://cldc.medichain.online/research Nasofaryngeal pinnprovsanalys. Prover kommer att utsättas för viral termisk inaktivering i 1 minut vid 90 °C. RNA-extraktion från nasofaryngeal-pinnen kommer att utföras med Abbott mSample Preparation System (Promega corporation) och ett automatiserat extraktionssystem (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). Det extraherade RNA:t kommer att amplifieras med GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR-kit (ELITechGroup), ett enstegs rRT-PCR-system riktat mot SARS-CoV-2 RdRp, E och N-gener. Alla rekryterade försökspersoner kommer att genomgå en nasofaryngeal pinne, så partiell verifieringsbias kommer att saknas. CLDC-testet och nasofaryngeala pinnprover kommer att utföras i samma ögonblick för att undvika bias för sjukdomsprogression. Eftersom CLCD-testet och den nasofaryngeala pinnprovet analyseras av oberoende blindade läkare, kommer informationsbias att undvikas vid tolkning av hastighets-PCR-resultaten för provtagningarna. Indextestet är helt oberoende av referenstestet, så för att undvika Incorporation-bias. Osäkra resultat kommer att registreras.

Provstorlek och statistisk analys. Incidensen av positivitet för covid-19 uppskattas för närvarande till 15 % i den allmänna befolkningen och 20 % hos högriskpersoner. Därför uppskattar man hitta mellan 150 och 200 positiva i en population på 1000 försökspersoner med olika risk för infektion.

En provstorlek på 1000 med en prevalens på 15 % av positiva nasofaryngeala pinnprover skulle räcka för att uppskatta en känslighet på omkring 0,75 med en precision på 0,15 för 95 % konfidensintervall och en styrka på 0,8.

Demografiska och kliniska egenskaper hos de kvalificerade deltagarna kommer att sammanfattas genom att använda medelvärde och standardandel, eller absoluta och relativa frekvenser, för kontinuerliga respektive diskreta variabler. Endast i beskrivande syfte kommer samma statistiska analyser att rapporteras även för positiva och negativa patienter med nasofaryngeal pinnprover. Vid tekniskt fel i testningen utan möjlighet att upprepa proceduren kommer deltagarna att uteslutas från ytterligare analyser. I de andra försökspersonerna kommer sensitiviteten och specificiteten för CLDC (indextest) jämfört med nasofarynxprovet (referenstest 1) eller FBC (referenstest 2) att uppskattas, och deras 95 % konfidensintervall kommer att beräknas från exakt binomialfördelning. Dessa analyser kommer också att replikeras enligt huvudämnesegenskaper. Deltagarna kommer att karakteriseras som sanna positiva (TP), falska positiva (FP), såväl som falska negativa (FN) och sanna negativa (TN), vad gäller prevalensen av positiva CLDC-PCR-, CLDC-FBC-resultat. Nollassociationen av ingen skillnad mellan TP, FP, FN och TN kommer att testas med ett Kruskal-Wallis-test.