Conta differenziale dei leucociti e diagnosi di Covid-19

Introduzione. Il 3 giugno 2020 il governo italiano ha avviato la cosiddetta "Fase 2", che prevedeva la riapertura delle attività lavorative e sociali. In questo quadro, la questione di come identificare gli individui asintomatici che, inconsapevolmente, possono diffondere l'infezione da SARS-CoV-2 e rappresentare una minaccia per la salute pubblica è stata sollevata in tutto il mondo. La popolazione mondiale sta ora vivendo la fase 3 della pandemia con un rapido aumento della diffusione dell'infezione e del verificarsi di nuovi casi. È ora imperativo garantire la salute e la sicurezza delle persone richiamate al lavoro e creare un protocollo di sicurezza negli spazi commerciali e di incontro, il che significa evitare che le persone infette causino nuovi focolai epidemici. A tal fine è necessario un programma di screening di massa consolidato che risponda a diverse esigenze: in primo luogo dovrebbe fornire il risultato in pochi minuti, dovrebbe essere facilmente recapitato sul territorio, gli operatori sanitari non medici dovrebbero eseguirlo in modo semplice modo anche, e dovrebbe essere non invasivo, ripetibile e affidabile.

Ad oggi, la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 viene fatta identificando l'RNA virale in campioni raccolti attraverso un tampone nasofaringeo o altri campioni respiratori. Questa tecnica, tuttavia, presenta diversi limiti per la sua applicazione in uno screening di massa, tra i quali i più importanti sono il tempo necessario alla diagnosi, l'affollamento dei centri deputati all'analisi dei campioni e il non trascurabile rischio di trasmissione virale agli operatori sanitari.

I test point-of-care con tempi di consegna rapidi consentirebbero un triage più efficace in contesti in cui le decisioni sulla gestione del paziente e sul controllo delle infezioni devono essere prese rapidamente.

Recentemente, è stato sviluppato un nuovo metodo per assolvere l'insorgenza di una grave infezione da Sar-COV-2 e conseguente COVID-19, rilevando l'aumento precoce dei livelli di leucociti che ha un insieme caratteristico di rapporti di tipi di leucociti, che identificano il patogeno virale e distinguerlo da molti altri. Questo test consente la previsione dei positivi dai risultati dell'emocromo, sensibili fino a 14 giorni prima della PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR), a un costo inferiore di almeno un ordine di grandezza rispetto ad altri test come RT-qPCR e anticorpi test.

Scopo dello studio. L'obiettivo principale dello studio sull'accuratezza diagnostica è convalidare l'uso del dispositivo e dell'algoritmo per la conta differenziale dei leucociti (CLDC) caratteristici del punto di cura per rilevare l'infezione da SARS-CoV-2 in individui sia sintomatici che asintomatici come approccio preliminare a una massa programma di screening. Il confronto è rappresentato dal test molecolare del tampone nasofaringeo, gold standard della diagnosi di COVID-19, per la validazione dell'algoritmo e dalle analisi citometriche ematologiche di Coulter HMX, Beckman Coulter, per la validazione del dispositivo.

Gli obiettivi secondari sono definire se i metodi CLCD sono in grado di rilevare l'infezione da SARS-CoV-2 in anticipo rispetto ai test molecolari su tampone e di eseguire uno studio di tracciamento dei contatti su tutti i pazienti doppiamente positivi per stimare la loro data originale di infezione per determinare la curva di sensibilità del test contro l'infezione iniziale.

Metodi. I soggetti sottoposti alla procedura del tampone rinofaringeo per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 saranno consecutivamente reclutati presso il Laboratorio Clinico dell'IRCCS Neuromed di Pozzilli e Diagnostica Medica Spa di Avellino, Italia. Saranno testati soggetti a basso e alto rischio di infezione da Sar-Cov-2: operatori sanitari, pazienti da ricoverare elettivamente per causa diversa da COVID-19 o altra malattia infettiva, persone che hanno avuto contatti diretti con pazienti infetti.

Contemporaneamente alla procedura del tampone nasofaringeo al mattino, ogni soggetto reclutato sarà anche testato utilizzando il dispositivo e l'algoritmo CLDC (CLCD 2). Su base volontaria, i soggetti saranno inoltre sottoposti a prelievo di sangue (3 ml) per analisi citometriche ematologiche da parte di Coulter HMX, Beckman Coulter e saranno testati utilizzando solo l'algoritmo CLDC (CLCD 1).

I valutatori dei risultati sono in cieco, poiché i risultati dell'analisi rRT-PCR richiedono almeno 6 ore prima di essere disponibili. Il personale di ricerca somministrerà un questionario sui sintomi e sui fattori di rischio COVID 19 e per il tracciamento dei contatti (giorno, modalità) I soggetti risultati positivi a entrambi i test CLDC ma negativi al tampone saranno sottoposti su base volontaria a un nuovo test del tampone dopo due, 5 e possibilmente 8 giorni se ancora negativo.

Medici indipendenti in cieco attraverso la trascrizione inversa in tempo reale (rRT)-PCR, analizzeranno il tampone nasofaringeo secondo le linee guida internazionali.

Per la convalida del dispositivo, l'emocromo completo (FBC) verrà analizzato sia misurando l'emocromo completo e inserendo i risultati nel portale Medichain CLDC-1 per un'analisi rapida sia attraverso il dispositivo point-of-care collegato allo smartphone (il Microscopio per smartphone Medichain CLDC-2 - il test Adstock).

Il microscopio per smartphone Medichain CLDC-2, un dispositivo che si aggancia a uno smartphone standard, verrà utilizzato per analizzare gocce di sangue di circa 1 µl spalmate su un vetrino da microscopio (versione 2 - Adstock Test) illuminato in modalità a contrasto di fase. Le immagini verranno quindi inviate dai dispositivi a Medichain per l'analisi sui server nel Regno Unito e il controllo incrociato manuale.

Quindi un algoritmo preparatorio Athena S3ER in grado di misurare parametri FBC specifici in ingresso analizza i dati da questo risultato e restituisce un output; tenendo conto della presenza anormale nel numero di parametri FBC specifici all'inizio dell'infezione. Il portale di test di base per questo studio (noto come algoritmo S3ER) sarebbe all'indirizzo http://cldc.medichain.online. Il portale esteso preferito è il portale di ricerca all'indirizzo http://cldc.medichain.online/research Analisi del tampone nasofaringeo. I campioni saranno sottoposti a inattivazione termica virale per 1 minuto a 90 °C. L'estrazione dell'RNA dal tampone rinofaringeo sarà eseguita con Abbott mSample Preparation System (Promega corporation) e un sistema di estrazione automatizzato (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). L'RNA estratto sarà amplificato con il kit GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR (ELITechGroup), un sistema rRT-PCR in una fase che prende di mira i geni SARS-CoV-2 RdRp, E e N. Tutti i soggetti reclutati saranno sottoposti al tampone rinofaringeo, pertanto sarà assente il bias di verifica parziale. Il test CLDC e le procedure del tampone nasofaringeo verranno eseguiti contemporaneamente per evitare bias di progressione della malattia. Essendo il test CLCD e il tampone rinofaringeo analizzati da clinici indipendenti in cieco, si eviteranno distorsioni informative durante l'interpretazione dei risultati della PCR dei tamponi. Il test dell'indice è completamente indipendente dal test di riferimento, in modo da evitare il bias di incorporazione. I risultati inconcludenti verranno registrati.

Dimensione del campione e analisi statistica. L'incidenza di positività al COVID-19 è attualmente stimata al 15% nella popolazione generale e al 20% nelle persone ad alto rischio. Pertanto, si stima di trovare tra i 150 ei 200 positivi su una popolazione di 1000 soggetti a diverso rischio di infezione.

Basterebbe un campione di 1000 con una prevalenza del 15% di tamponi nasofaringei positivi per stimare una sensibilità di circa 0,75 con una precisione di 0,15 per l'intervallo di confidenza del 95% e una potenza di 0,8.

Le caratteristiche demografiche e cliniche dei partecipanti idonei saranno riassunte utilizzando la media e la proporzione standard, o le frequenze assolute e relative, rispettivamente per variabili continue e discrete. A solo scopo descrittivo, le stesse analisi statistiche saranno riportate anche nei soggetti positivi e negativi al tampone nasofaringeo. In caso di fallimento tecnico del test senza la possibilità di ripetere la procedura, i partecipanti saranno esclusi da ulteriori analisi. Negli altri soggetti, saranno stimate la sensibilità e la specificità per il CLDC (test indice) rispetto al tampone nasofaringeo (test di riferimento 1) o al FBC (test di riferimento 2) e il loro intervallo di confidenza al 95% sarà calcolato dal distribuzione binomiale esatta. Queste analisi saranno replicate anche in base alle principali caratteristiche del soggetto. I partecipanti saranno caratterizzati come veri positivi (TP), falsi positivi (FP), nonché falsi negativi (FN) e veri negativi (TN), in termini di prevalenza di risultati positivi CLDC-PCR, CLDC-FBC. L'associazione nulla di nessuna differenza tra TP, FP, FN e TN verrà testata utilizzando un test di Kruskal-Wallis.