Contagem diferencial de leucócitos e diagnóstico de Covid-19

Introdução. Em 3 de junho de 2020, o governo italiano iniciou a chamada "Fase 2", que incluiu a reabertura das atividades laborais e sociais. Nesse contexto, a questão de como identificar os indivíduos assintomáticos que, involuntariamente, podem espalhar a infecção por SARS-CoV-2 e representar uma ameaça à saúde pública foi levantada em todo o mundo. A população mundial vive agora a fase 3 da pandemia com um rápido aumento na propagação da infecção e na ocorrência de novos casos. É agora imperativo garantir a saúde e a segurança das pessoas chamadas de regresso ao trabalho e criar um protocolo de segurança nos espaços comerciais e de reunião, o que significa evitar que os infetados provoquem novos surtos epidémicos. Para isso, é necessário um programa de triagem em massa bem estabelecido que atenda a várias necessidades: primeiro, deve fornecer o resultado em poucos minutos, deve ser facilmente entregue no território, profissionais de saúde não médicos devem realizá-lo de maneira simples também, e deve ser não invasivo, repetível e confiável.

Até o momento, o diagnóstico da infecção por SARS-CoV-2 é feito pela identificação do RNA viral em amostras coletadas por meio de swab nasofaríngeo ou outras amostras respiratórias. Esta técnica, no entanto, tem várias limitações para sua aplicação em triagem em massa, entre as quais as mais importantes são o tempo necessário para o diagnóstico, a superlotação dos centros designados para analisar as amostras e o risco não desprezível de transmissão viral aos trabalhadores da saúde.

Os testes no local de atendimento com tempos de resposta rápidos permitiriam uma triagem mais eficaz em ambientes onde o gerenciamento de pacientes e as decisões de controle de infecção precisam ser tomadas rapidamente.

Recentemente, foi desenvolvido um novo método para absolver a ocorrência de infecção grave por Sar-COV-2 e COVID-19 resultante, detectando o aumento precoce dos níveis de leucócitos que possui um conjunto característico de proporções de tipos de leucócitos, que identificam o patógeno viral e diferenciá-lo de vários outros. Este teste permite prever a positividade a partir dos resultados do hemograma completo, sensível até 14 dias antes do PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR), a um custo pelo menos uma ordem de grandeza inferior a outros testes como RT-qPCR e anticorpo testes.

Objetivo do estudo. O objetivo principal do estudo de precisão diagnóstica é validar o uso do dispositivo e algoritmo de contagem diferencial de leucócitos (CLDC) característico do local de atendimento para detectar a infecção por SARS-CoV-2 em indivíduos sintomáticos e assintomáticos como uma abordagem preliminar para uma massa programa de triagem. A comparação é representada pelo teste molecular de swab nasofaríngeo, padrão-ouro do diagnóstico de COVID-19, para validação de algoritmos e análises citométricas hematológicas por Coulter HMX, Beckman Coulter, para validação de dispositivos.

Os objetivos secundários são definir se os métodos CLCD são capazes de detectar a infecção por SARS-CoV-2 mais cedo em comparação com o teste molecular de swab e realizar um estudo de rastreamento de contato em todos os pacientes duplo-positivos para estimar sua data original de infecção para determinar a curva de testar a sensibilidade contra a infecção inicial.

Métodos. Os indivíduos submetidos ao procedimento de swab nasofaríngeo para o diagnóstico de infecção por SARS-CoV-2 serão recrutados consecutivamente no Laboratório Clínico do IRCCS Neuromed em Pozzilli e Diagnostica Medica Spa em Avellino, Itália. Serão testados indivíduos com baixo e alto risco de infecção por Sar-Cov-2: profissionais de saúde, pacientes em internação eletiva por motivo diferente de COVID-19 ou outra doença infecciosa, pessoas que tiveram contato direto com pacientes infectados.

Ao mesmo tempo do procedimento de swab nasofaríngeo pela manhã, cada indivíduo recrutado também será testado usando dispositivo e algoritmo CLDC (CLCD 2). De forma voluntária, os indivíduos também serão submetidos a coleta de sangue (3 ml) para análises citométricas hematológicas por Coulter HMX, Beckman Coulter e serão testados usando apenas o algoritmo CLDC (CLCD 1).

Os avaliadores dos resultados são cegos, uma vez que os resultados da análise rRT-PCR requerem pelo menos 6 horas antes de estarem disponíveis. O pessoal da pesquisa administrará um questionário sobre os sintomas e fatores de risco do COVID 19 e para rastreamento de contato (dia, modo) Os indivíduos com teste positivo em qualquer teste CLDC, mas negativo no swab, serão submetidos voluntariamente a novos testes de swab após dois, 5 e possivelmente 8 dias se ainda negativo.

Clínicos cegos independentes por meio de transcrição reversa em tempo real (rRT)-PCR analisarão o swab nasofaríngeo de acordo com as diretrizes internacionais.

Para a validação do dispositivo, a contagem total de sangue (FBC) será analisada medindo a contagem total de sangue e inserindo os resultados no portal Medichain CLDC-1 para análise rápida e por meio do dispositivo de ponto de atendimento conectado ao smartphone (o Microscópio de smartphone Medichain CLDC-2 - o teste de Adstock).

O microscópio de smartphone Medichain CLDC-2, um dispositivo que se prende a um smartphone padrão, será usado para analisar gotas de sangue de aproximadamente 1µl espalhadas em uma lâmina de microscópio (versão 2 - Teste de Adstock) iluminada no modo de contraste de fase. As imagens serão enviadas dos dispositivos para a Medichain para análise em servidores no Reino Unido e verificação cruzada manual.

Em seguida, um algoritmo preparatório Athena S3ER capaz de medir parâmetros FBC específicos de entrada analisa os dados desse resultado e retorna uma saída; levando em consideração a ocorrência anormal em números de parâmetros específicos de hemograma completo no início da infecção. O portal de teste básico para este estudo (conhecido como o algoritmo S3ER) seria em http://cldc.medichain.online. O portal estendido preferido é o portal de pesquisa em http://cldc.medichain.online/research Análise de swab nasofaríngeo. As amostras serão submetidas à inativação térmica viral por 1 minuto a 90 °C. A extração de RNA do swab nasofaríngeo será realizada com o Sistema de Preparação Abbott mSample (Promega Corporation) e um sistema de extração automatizado (Extração m2000SP, Abbott Molecular). O RNA extraído será amplificado com o kit GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR (ELITechGroup), um sistema rRT-PCR de uma etapa direcionado aos genes SARS-CoV-2 RdRp, E e N. Todos os indivíduos recrutados serão submetidos ao swab nasofaríngeo, portanto, o viés de verificação parcial estará ausente. O teste CLDC e os procedimentos de swab nasofaríngeo serão realizados no mesmo momento para evitar viés de progressão da doença. Sendo o teste CLCD e o swab nasofaríngeo analisados ​​por médicos cegos independentes, o viés de informação será evitado ao interpretar os resultados da taxa de PCR dos swabs. O teste de índice é completamente independente do teste de referência, para evitar o viés de incorporação. Resultados inconclusivos serão registrados.

Tamanho da amostra e análise estatística. A incidência de positividade para COVID-19 é atualmente estimada em 15% na população geral e 20% em pessoas de alto risco. Portanto, estima encontrar entre 150 e 200 positivos em uma população de 1000 indivíduos com diferentes riscos de infecção.

Um tamanho de amostra de 1000 com uma prevalência de 15% de swabs nasofaríngeos positivos seria suficiente para estimar uma sensibilidade em torno de 0,75 com uma precisão de 0,15 para o intervalo de confiança de 95% e um poder de 0,8.

As características demográficas e clínicas dos participantes elegíveis serão resumidas usando proporção média e padrão, ou frequências absolutas e relativas, para variáveis ​​contínuas e discretas, respectivamente. Apenas para fins descritivos, as mesmas análises estatísticas serão relatadas também em indivíduos com swab nasofaríngeo positivo e negativo. Em caso de falha técnica do teste sem possibilidade de repetição do procedimento, os participantes serão excluídos de novas análises. Nos demais sujeitos, serão estimadas a sensibilidade e a especificidade do CLDC (teste índice) quando comparado ao swab nasofaríngeo (teste de referência 1) ou ao hemograma completo (teste de referência 2), e seu intervalo de confiança de 95% será calculado a partir da distribuição binomial exata. Essas análises também serão replicadas de acordo com as principais características dos sujeitos. Os participantes serão caracterizados como verdadeiros positivos (TP), falsos positivos (FP), bem como falsos negativos (FN) e verdadeiros negativos (TN), em termos de prevalência de resultados positivos de CLDC-PCR, CLDC-FBC. A associação nula de nenhuma diferença entre TP, FP, FN e TN será testada usando um teste de Kruskal-Wallis.