Diferenciální počet leukocytů a diagnostika Covid-19

Úvod. Dne 3. června 2020 zahájila italská vláda tzv. „Fáze 2“, která zahrnovala znovuotevření pracovních a společenských aktivit. V tomto rámci se celosvětově objevila otázka, jak identifikovat asymptomatické jedince, kteří mohou nevědomky šířit infekci SARS-CoV-2 a představovat hrozbu pro veřejné zdraví. Světová populace nyní zažívá fázi 3 pandemie s rychlým nárůstem šíření infekce a výskytu nových případů. Nyní je nezbytné zaručit zdraví a bezpečnost lidí povolaných zpět do práce a vytvořit bezpečnostní protokol v obchodních a zasedacích prostorách, což znamená zabránit infikovaným lidem ve způsobování nových epidemií. K tomuto účelu je zapotřebí dobře zavedený program hromadného screeningu, který splňuje několik potřeb: za prvé by měl poskytnout výsledek během několika minut, měl by být snadno dodán na území, nelékařští zdravotničtí pracovníci by jej měli provést v jednoduchém a měl by být neinvazivní, opakovatelný a spolehlivý.

K dnešnímu dni je diagnóza infekce SARS-CoV-2 prováděna identifikací virové RNA ve vzorcích odebraných z nosohltanového výtěru nebo jiných vzorků z dýchacích cest. Tato technika má však několik omezení pro její použití v hromadném screeningu, z nichž nejdůležitější jsou čas potřebný k diagnóze, přeplněnost center určených k analýze vzorků a nezanedbatelné riziko přenosu viru. zdravotnickým pracovníkům.

Testování v místě péče s rychlou dobou obratu by umožnilo efektivnější třídění v prostředích, kde je třeba rychle přijímat rozhodnutí o léčbě pacientů a kontrole infekcí.

Nedávno byla vyvinuta nová metoda zmírnění výskytu závažné infekce Sar-COV-2 a následného COVID-19, detekce časného vzestupu hladin leukocytů, která má charakteristický soubor poměrů typů leukocytů, které identifikují virový patogen. a odlišit ji od řady dalších. Tento test umožňuje predikci pozitivity z výsledků úplného krevního obrazu, citlivých až o 14 dní dříve než kvantitativní PCR v reálném čase (RT-qPCR), za cenu minimálně o řád nižší než jiné testy, jako je RT-qPCR a protilátka testy.

Cíl studie. Primárním cílem studie diagnostické přesnosti je ověřit použití zařízení a algoritmu charakteristické pro diferenciální počet leukocytů (CLDC) v místě péče k detekci infekce SARS-CoV-2 u symptomatických i asymptomatických jedinců jako předběžného přístupu k masovému screeningový program. Srovnání představuje molekulární testování nosohltanového výtěru, zlatý standard diagnostiky COVID-19, pro validaci algoritmů a hematologické cytometrické analýzy od Coulter HMX, Beckman Coulter, pro validaci zařízení.

Sekundárním cílem je definovat, zda jsou metody CLCD schopny detekovat infekci SARS-CoV-2 dříve ve srovnání s molekulárním testováním stěrem, a provést studii sledování kontaktu na všech dvojitě pozitivních pacientech s cílem odhadnout jejich původní datum infekce a určit křivku test citlivosti proti počáteční infekci.

Metody. Subjekty, které podstoupí proceduru výtěru z nosohltanu pro diagnostiku infekce SARS-CoV-2, budou postupně zařazovány do klinické laboratoře IRCCS Neuromed v Pozzilli a Diagnostica Medica Spa v Avellinu v Itálii. Testováni budou jedinci s nízkým a vysokým rizikem infekce Sar-Cov-2: zdravotničtí pracovníci, pacienti, kteří mají být elektivně hospitalizováni z jiného důvodu než COVID-19 nebo jiné infekční onemocnění, osoby, které byly v přímém kontaktu s infikovanými pacienty.

Současně s ranním výtěrem z nosohltanu bude každý přijatý subjekt také testován pomocí zařízení a algoritmu CLDC (CLCD 2). Na dobrovolné bázi budou subjekty také podrobeny odběru krve (3 ml) pro hematologické cytometrické analýzy pomocí Coulter HMX, Beckman Coulter a budou testovány pouze pomocí algoritmu CLDC (CLCD 1).

Hodnotitelé výsledků jsou zaslepení, protože výsledky analýzy rRT-PCR vyžadují alespoň 6 hodin, než budou k dispozici. Výzkumní pracovníci zadají dotazník o příznacích a rizikových faktorech COVID 19 a pro sledování kontaktu (den, režim) Subjekty s pozitivním testem CLDC, ale negativním na výtěru, podstoupí dobrovolně nové testování výtěru po dvou, 5 a možná 8 dnů, pokud je stále negativní.

Nezávislí zaslepení lékaři prostřednictvím reverzní transkripce (rRT)-PCR v reálném čase analyzují výtěr z nosohltanu v souladu s mezinárodními směrnicemi.

Pro ověření zařízení bude analyzován plný krevní obraz (FBC) jak měřením plného krevního obrazu, tak zadáním výsledků do portálu Medichain CLDC-1 pro rychlou analýzu a prostřednictvím zařízení v místě péče připojeného k chytrému telefonu (tzv. Mikroskop pro chytré telefony Medichain CLDC-2 – test Adstock).

Mikroskop Medichain CLDC-2 pro chytré telefony, zařízení, které se připne na standardní smartphone, bude použit k analýze kapek krve o objemu přibližně 1 µl rozmazaných na mikroskopickém sklíčku (verze 2 - Adstock Test) osvětleném v režimu fázového kontrastu. Obrázky budou poté odeslány ze zařízení do Medichainu k analýze na serverech ve Spojeném království a ruční křížové kontrole.

Poté přípravný algoritmus Athena S3ER schopný měřit vstupní specifické parametry FBC analyzuje data z tohoto výsledku a vrací výstup; s přihlédnutím k abnormálnímu výskytu v počtu specifických parametrů FBC na počátku infekce. Základní testovací portál pro tuto studii (známý jako algoritmus S3ER) by byl na adrese http://cldc.medichain.online. Preferovaným rozšířeným portálem je výzkumný portál na adrese http://cldc.medichain.online/research Analýza výtěru z nosohltanu. Vzorky budou vystaveny virové tepelné inaktivaci po dobu 1 minuty při 90 °C. Extrakce RNA z nazofaryngeálního výtěru bude provedena pomocí Abbott mSample Preparation System (Promega corporation) a automatizovaného extrakčního systému (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). Extrahovaná RNA bude amplifikována pomocí GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR kit (ELITechGroup), jednostupňového systému rRT-PCR zaměřeného na SARS-CoV-2 RdRp, E a N geny. Všichni vybraní jedinci podstoupí výtěr z nosohltanu, takže částečné zkreslení ověření bude odstraněno. Test CLDC a postupy výtěru z nosohltanu budou provedeny ve stejný okamžik, aby se zabránilo zkreslení progrese onemocnění. Vzhledem k tomu, že test CLCD a výtěr z nosohltanu analyzují nezávislí zaslepení lékaři, zabrání se zkreslení informací při interpretaci výsledků rychlostních PCR výtěrů. Indexový test je zcela nezávislý na referenčním testu, aby se předešlo zkreslení Incorporation. Neprůkazné výsledky budou zaznamenány.

Velikost vzorku a statistická analýza. Výskyt pozitivity na COVID-19 se v současnosti odhaduje na 15 % v běžné populaci a 20 % u vysoce rizikových osob. Proto odhaduje, že najde 150 až 200 pozitivních v populaci 1000 subjektů s různým rizikem infekce.

Velikost vzorku 1 000 s prevalencí 15 % pozitivních výtěrů z nosohltanu by stačila k odhadu citlivosti kolem 0,75 s přesností 0,15 pro 95% interval spolehlivosti a mocninou 0,8.

Demografické a klinické rysy způsobilých účastníků budou shrnuty pomocí středního a standardního podílu nebo absolutní a relativní četnosti pro spojité a diskrétní proměnné. Pouze pro popisné účely budou stejné statistické analýzy uváděny také u pacientů s pozitivním a negativním nazofaryngeálním výtěrem. V případě technického výpadku testování bez možnosti opakování postupu budou účastníci z dalších analýz vyloučeni. U ostatních subjektů bude odhadnuta senzitivita a specificita pro CLDC (indexový test) ve srovnání s výtěrem z nosohltanu (referenční test 1) nebo s FBC (referenční test 2) a jejich 95% interval spolehlivosti bude vypočten z přesné binomické rozdělení. Tyto analýzy budou také replikovány podle hlavních charakteristik předmětu. Účastníci budou charakterizováni jako pravdivě pozitivní (TP), falešně pozitivní (FP), stejně jako falešně negativní (FN) a pravdivě negativní (TN), z hlediska prevalence pozitivních výsledků CLDC-PCR, CLDC-FBC. Nulová asociace bez rozdílu mezi TP, FP, FN a TN bude testována pomocí Kruskal-Wallisova testu.