Differentialleukozytenzahl und Covid-19-Diagnose

Einführung. Am 3. Juni 2020 startete die italienische Regierung die sogenannte „Phase 2“, die die Wiedereröffnung von Arbeits- und Sozialaktivitäten beinhaltete. In diesem Rahmen wurde weltweit die Frage aufgeworfen, wie asymptomatische Personen identifiziert werden können, die unwissentlich eine SARS-CoV-2-Infektion verbreiten und eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellen können. Die mondiale Bevölkerung erlebt nun die Phase 3 der Pandemie mit einem rasanten Anstieg der Infektionsausbreitung und des Auftretens neuer Fälle. Es ist jetzt unerlässlich, die Gesundheit und Sicherheit der zur Arbeit zurückgerufenen Personen zu gewährleisten und ein Sicherheitsprotokoll in Geschäfts- und Versammlungsräumen zu erstellen, was bedeutet, dass verhindert wird, dass infizierte Personen neue Epidemieausbrüche verursachen. Zu diesem Zweck ist ein gut etabliertes Massen-Screening-Programm erforderlich, das mehrere Anforderungen erfüllt: Erstens sollte es das Ergebnis in wenigen Minuten liefern, es sollte auf dem Gebiet leicht geliefert werden können, und es sollte von nichtmedizinischen Gesundheitsfachkräften einfach durchgeführt werden können Weise und sollte nicht-invasiv, wiederholbar und zuverlässig sein.

Bisher wird die Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion durch die Identifizierung der viralen RNA in Proben gestellt, die durch einen Nasen-Rachen-Abstrich oder andere Atemwegsproben entnommen wurden. Diese Technik weist jedoch mehrere Einschränkungen für ihre Anwendung in einem Massenscreening auf, von denen die wichtigsten die für die Diagnose erforderliche Zeit, die Überfüllung der mit der Analyse der Proben beauftragten Zentren und das nicht zu vernachlässigende Risiko einer Virusübertragung sind an die Beschäftigten im Gesundheitswesen.

Point-of-Care-Tests mit schnellen Durchlaufzeiten würden eine effektivere Triage in Umgebungen ermöglichen, in denen Entscheidungen zum Patientenmanagement und zur Infektionskontrolle schnell getroffen werden müssen.

Kürzlich wurde eine neue Methode entwickelt, um das Auftreten einer schweren Sar-COV-2-Infektion und des daraus resultierenden COVID-19 freizusprechen und den frühen Anstieg der Leukozytenwerte zu erkennen, der einen charakteristischen Satz von Verhältnissen von Leukozytentypen aufweist, die den viralen Erreger identifizieren und von vielen anderen unterscheiden. Dieser Test ermöglicht die Vorhersage positiver Ergebnisse aus Vollblutbildergebnissen, ist bis zu 14 Tage früher empfindlich als quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) und kostet mindestens eine Größenordnung weniger als andere Tests wie RT-qPCR und Antikörper Prüfungen.

Ziel der Studie. Das Hauptziel der Studie zur diagnostischen Genauigkeit ist die Validierung der Verwendung des Point-of-Care-charakteristischen Differenzialleukozytenzählgeräts (CLDC) und des Algorithmus zum Nachweis einer SARS-CoV-2-Infektion sowohl bei symptomatischen als auch bei asymptomatischen Personen als vorläufiger Ansatz für eine Masse Screening-Programm. Der Vergleich wird durch den molekularen Nasen-Rachen-Abstrich-Test, den Goldstandard der COVID-19-Diagnose, für die Algorithmusvalidierung und hämatologische zytometrische Analysen von Coulter HMX, Beckman Coulter, für die Gerätevalidierung dargestellt.

Sekundäre Ziele sind zu definieren, ob CLCD-Methoden in der Lage sind, eine SARS-CoV-2-Infektion im Vergleich zu molekularen Abstrichtests früher zu erkennen, und eine Kontaktverfolgungsstudie an allen doppelt positiven Patienten durchzuführen, um ihr ursprüngliches Infektionsdatum abzuschätzen und die Kurve zu bestimmen von Empfindlichkeit gegen Erstinfektion testen.

Methoden. Probanden, die sich dem nasopharyngealen Abstrichverfahren zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion unterziehen, werden nacheinander im klinischen Labor des IRCCS Neuromed in Pozzilli und im Diagnostica Medica Spa in Avellino, Italien, rekrutiert. Personen mit niedrigem und hohem Risiko einer Sar-Cov-2-Infektion werden getestet: medizinisches Personal, Patienten, die aus anderen Gründen als COVID-19 oder einer anderen Infektionskrankheit wahlfrei ins Krankenhaus eingeliefert werden sollen, Personen, die direkten Kontakt mit infizierten Patienten hatten.

Gleichzeitig mit dem Nasopharynx-Abstrichverfahren am Morgen wird jede rekrutierte Person auch mit dem CLDC-Gerät und dem Algorithmus (CLCD 2) getestet. Auf freiwilliger Basis werden die Probanden auch einer Blutentnahme (3 ml) für hämatologische zytometrische Analysen durch Coulter HMX, Beckman Coulter unterzogen und nur mit dem CLDC-Algorithmus (CLCD 1) getestet.

Die Ergebnisbewerter sind verblindet, da die Ergebnisse der rRT-PCR-Analyse mindestens 6 Stunden benötigen, bevor sie vorliegen. Das Forschungspersonal wird einen Fragebogen zu den Symptomen und Risikofaktoren von COVID 19 und zur Kontaktverfolgung (Tag, Modus) ausfüllen. Probanden, die bei einem der CLDC-Tests positiv, aber beim Abstrich negativ getestet wurden, werden auf freiwilliger Basis nach zwei, fünf und möglicherweise acht Mal einem neuen Abstrichtest unterzogen Tage, wenn immer noch negativ.

Unabhängige, verblindete Kliniker analysieren den Nasen-Rachen-Abstrich mittels Echtzeit-Reverse-Transkription (rRT)-PCR gemäß den internationalen Richtlinien.

Für die Gerätevalidierung wird das Full Blood Count (FBC) analysiert, indem sowohl das Full Blood Count gemessen als auch die Ergebnisse zur schnellen Analyse in das Medichain CLDC-1-Portal eingegeben werden und über das mit dem Smartphone verbundene Point-of-Care-Gerät (das Medichain CLDC-2 Smartphone-Mikroskop - der Adstock-Test).

Das Smartphone-Mikroskop Medichain CLDC-2, ein Gerät, das an ein Standard-Smartphone geklemmt wird, wird verwendet, um Blutstropfen von etwa 1 µl zu analysieren, die auf einem im Phasenkontrastmodus beleuchteten Objektträger (Version 2 - Adstock-Test) verschmiert sind. Die Bilder werden dann von den Geräten zur Analyse auf Servern in Großbritannien und zur manuellen Gegenprüfung an Medichain gesendet.

Dann analysiert ein vorbereitender Algorithmus Athena S3ER, der eingabespezifische FBC-Parameter messen kann, Daten aus diesem Ergebnis und gibt eine Ausgabe zurück; unter Berücksichtigung des anormalen Auftretens in Zahlen spezifischer FBC-Parameter zu Beginn der Infektion. Das grundlegende Testportal für diese Studie (bekannt als S3ER-Algorithmus) wäre unter http://cldc.medichain.online. Das bevorzugte erweiterte Portal ist das Forschungsportal unter http://cldc.medichain.online/research Nasopharynxabstrich-Analyse. Die Proben werden einer viralen thermischen Inaktivierung für 1 Minute bei 90 °C unterzogen. Die RNA-Extraktion aus dem Nasen-Rachen-Abstrich wird mit dem Abbott mSample Preparation System (Promega Corporation) und einem automatisierten Extraktionssystem (Extraction m2000SP, Abbott Molecular) durchgeführt. Die extrahierte RNA wird mit dem GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR-Kit (ELITechGroup) amplifiziert, einem einstufigen rRT-PCR-System, das auf die RdRp-, E- und N-Gene von SARS-CoV-2 abzielt. Alle rekrutierten Probanden werden dem Nasen-Rachen-Abstrich unterzogen, daher wird eine teilweise Verifizierungsverzerrung fehlen. Der CLDC-Test und die Nasen-Rachen-Abstrichverfahren werden gleichzeitig durchgeführt, um eine Verzerrung des Krankheitsverlaufs zu vermeiden. Da der CLCD-Test und der Nasen-Rachen-Abstrich von unabhängigen, verblindeten Klinikern analysiert werden, wird eine Informationsverzerrung bei der Interpretation der Rate-PCR-Ergebnisse der Abstriche vermieden. Der Indextest ist völlig unabhängig vom Referenztest, um die Verzerrung durch die Einbeziehung zu vermeiden. Nicht schlüssige Ergebnisse werden aufgezeichnet.

Stichprobengröße und statistische Analyse. Die Inzidenz von Positivität für COVID-19 wird derzeit auf 15 % in der Allgemeinbevölkerung und auf 20 % bei Personen mit hohem Risiko geschätzt. Daher wird geschätzt, dass in einer Population von 1000 Probanden mit unterschiedlichem Infektionsrisiko zwischen 150 und 200 Positive gefunden werden.

Eine Stichprobengröße von 1000 mit einer Prävalenz von 15 % positiver Nasen-Rachen-Abstriche würde ausreichen, um eine Sensitivität von etwa 0,75 mit einer Genauigkeit von 0,15 für das 95-%-Konfidenzintervall und einer Power von 0,8 zu schätzen.

Die demografischen und klinischen Merkmale der teilnahmeberechtigten Teilnehmer werden zusammengefasst, indem mittlere und Standardanteile oder absolute und relative Häufigkeiten für kontinuierliche bzw. diskrete Variablen verwendet werden. Nur zu beschreibenden Zwecken werden dieselben statistischen Analysen auch bei positiven und negativen Nasen-Rachen-Abstrich-Probanden berichtet. Bei technischem Scheitern der Prüfung ohne Möglichkeit zur Wiederholung des Verfahrens werden die Teilnehmer von weiteren Analysen ausgeschlossen. Bei den anderen Probanden wird die Sensitivität und Spezifität für den CLDC (Indextest) im Vergleich zum Nasopharynxabstrich (Referenztest 1) oder zu FBC (Referenztest 2) geschätzt und ihr 95 %-Konfidenzintervall wird daraus berechnet exakte Binomialverteilung. Auch diese Analysen werden nach Hauptfachmerkmalen repliziert. Die Teilnehmer werden in Bezug auf die Prävalenz positiver CLDC-PCR- und CLDC-FBC-Ergebnisse als richtig positiv (TP), falsch positiv (FP) sowie falsch negativ (FN) und richtig negativ (TN) charakterisiert. Die Nullassoziation von keinem Unterschied zwischen TP, FP, FN und TN wird unter Verwendung eines Kruskal-Wallis-Tests getestet.