Differentiële leukocytentelling en covid-19-diagnose

Invoering. Op 3 juni 2020 startte de Italiaanse regering de zogenaamde "Fase 2", die de heropening van werk- en sociale activiteiten omvatte. In dit kader is wereldwijd de vraag opgeworpen hoe de asymptomatische personen kunnen worden geïdentificeerd die, onbewust, een SARS-CoV-2-infectie kunnen verspreiden en een bedreiging vormen voor de volksgezondheid. De mondiale bevolking maakt nu fase 3 van de pandemie door met een snelle toename van de verspreiding van infecties en het optreden van nieuwe gevallen. Het is nu absoluut noodzakelijk om de gezondheid en veiligheid te garanderen van de mensen die weer aan het werk zijn en om een ​​veiligheidsprotocol op te stellen in commerciële en vergaderruimtes, wat inhoudt dat wordt voorkomen dat geïnfecteerde mensen nieuwe epidemieën uitbreken. Voor dit doel is een goed ingeburgerd massascreeningsprogramma nodig om aan verschillende behoeften te voldoen: ten eerste moet het de uitslag binnen enkele minuten opleveren, het moet gemakkelijk op het grondgebied kunnen worden afgeleverd, niet-medische beroepsbeoefenaren in de gezondheidszorg moeten het op een eenvoudige manier uitvoeren manier ook, en zou niet-invasief, herhaalbaar en betrouwbaar moeten zijn.

Tot op heden wordt de diagnose van SARS-CoV-2-infectie gesteld door het virale RNA te identificeren in monsters die zijn verzameld via een nasofaryngeaal uitstrijkje of andere ademhalingsmonsters. Deze techniek heeft echter verschillende beperkingen voor de toepassing ervan bij een massale screening, waarvan de belangrijkste de tijd zijn die nodig is voor de diagnose, de drukte van de centra die zijn aangewezen om de monsters te analyseren en het niet te verwaarlozen risico van virale overdracht. aan de zorgmedewerkers.

Point-of-care-testen met snelle doorlooptijden zouden een effectievere triage mogelijk maken in omgevingen waar beslissingen over patiëntbeheer en infectiebeheersing snel moeten worden genomen.

Onlangs is een nieuwe methode ontwikkeld om het optreden van een ernstige Sar-COV-2-infectie en de resulterende COVID-19 vrij te spreken, waarbij de vroege stijging van het aantal leukocyten wordt gedetecteerd, wat een kenmerkende reeks verhoudingen van leukocytentypes heeft, die de virale ziekteverwekker identificeren en onderscheiden van een aantal anderen. Deze test maakt voorspelling van positieve resultaten van volledige bloedbeeldresultaten mogelijk, gevoelig tot 14 dagen eerder dan real-time kwantitatieve PCR (RT-qPCR), tegen kosten die ten minste een orde van grootte lager zijn dan bij andere tests zoals RT-qPCR en antilichaamtesten. testen.

Doel van de studie. Het primaire doel van de Diagnostic Accuracy-studie is het valideren van het gebruik van het point-of-care-karakteristieke Differential Leucocyte Count (CLDC)-apparaat en -algoritme om SARS-CoV-2-infectie te detecteren bij zowel symptomatische als asymptomatische individuen als een voorlopige benadering van een massale screening programma. De vergelijking wordt weergegeven door de moleculaire tests met nasofaryngeale uitstrijkjes, de gouden standaard voor COVID-19-diagnose, voor algoritmevalidatie en hematologische cytometrische analyses door Coulter HMX, Beckman Coulter, voor apparaatvalidatie.

Secundaire doelen zijn om te bepalen of CLCD-methoden in staat zijn om SARS-CoV-2-infectie eerder op te sporen in vergelijking met moleculaire uitstrijkjes, en om een ​​contactopsporingsonderzoek uit te voeren bij alle dubbelpositieve patiënten om hun oorspronkelijke infectiedatum te schatten om de curve van test gevoeligheid tegen initiële infectie.

methoden. Proefpersonen die de nasofaryngeale uitstrijkprocedure ondergaan voor de diagnose van SARS-CoV-2-infectie, zullen achtereenvolgens worden gerekruteerd in het Clinic Laboratory van IRCCS Neuromed in Pozzilli en Diagnostica Medica Spa in Avellino, Italië. Onderwerpen met een laag en hoog risico op Sar-Cov-2-infectie zullen worden getest: gezondheidswerkers, patiënten die electief in het ziekenhuis moeten worden opgenomen om een ​​andere reden dan COVID-19 of een andere besmettelijke ziekte, personen die direct contact hebben gehad met geïnfecteerde patiënten.

Op hetzelfde tijdstip van de nasofaryngeale uitstrijkprocedure in de ochtend wordt elke gerekruteerde proefpersoon ook getest met behulp van het CLDC-apparaat en algoritme (CLCD 2). Op vrijwillige basis ondergaan proefpersonen ook bloedafname (3 ml) voor hematologische cytometrische analyses door Coulter HMX, Beckman Coulter en worden ze getest met alleen het CLDC-algoritme (CLCD 1).

De uitkomstbeoordelaars zijn geblindeerd, aangezien de resultaten van de rRT-PCR-analyse minimaal 6 uur nodig hebben voordat ze beschikbaar zijn. Onderzoekspersoneel zal een vragenlijst afnemen over COVID 19-symptomen en risicofactoren en voor contactonderzoek (dag, modus) Proefpersonen die positief testen op een van beide CLDC-testen maar negatief bij het uitstrijkje, ondergaan op vrijwillige basis een nieuwe uitstrijkje na twee, 5 en mogelijk 8 dagen indien nog steeds negatief.

Onafhankelijke geblindeerde clinici zullen door middel van real-time reverse transcriptie (rRT)-PCR het nasofaryngeale uitstrijkje analyseren volgens de internationale richtlijnen.

Voor de validatie van het apparaat wordt de volledige bloedtelling (FBC) geanalyseerd door zowel de volledige bloedtelling te meten als de resultaten in te voeren in de Medichain CLDC-1-portal voor snelle analyse en via het point-of-care-apparaat dat is aangesloten op de smartphone (de Medichain CLDC-2 smartphonemicroscoop - de Adstock-test).

De Medichain CLDC-2 smartphone-microscoop, een apparaat dat op een standaard smartphone kan worden geklikt, zal worden gebruikt om bloeddruppels van ongeveer 1 µl te analyseren die zijn uitgesmeerd op een microscoopglaasje (versie 2 - Adstock-test) verlicht in fasecontrastmodus. Afbeeldingen worden vervolgens van de apparaten naar Medichain gestuurd voor analyse op servers in het VK en handmatige kruiscontrole.

Vervolgens analyseert een voorbereidend algoritme Athena S3ER, dat in staat is om invoerspecifieke FBC-parameters te meten, gegevens van dit resultaat en retourneert een uitvoer; rekening houdend met abnormaal voorkomen in aantallen specifieke FBC-parameters bij het begin van de infectie. Het basistestportaal voor deze studie (bekend als het S3ER-algoritme) zou zijn op http://cldc.medichain.online. Het uitgebreide portaal dat de voorkeur heeft, is het onderzoeksportaal op http://cldc.medichain.online/research Analyse van nasofaryngeale uitstrijkjes. Monsters worden onderworpen aan virale thermische inactivatie gedurende 1 minuut bij 90 °C. RNA-extractie uit het nasofaryngeale uitstrijkje zal worden uitgevoerd met het Abbott mSample Preparation System (Promega Corporation) en een geautomatiseerd extractiesysteem (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). Het geëxtraheerde RNA zal worden geamplificeerd met GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR-kit (ELITechGroup), een eenstaps rRT-PCR-systeem gericht op SARS-CoV-2 RdRp-, E- en N-genen. Alle gerekruteerde proefpersonen ondergaan het nasofaryngeale uitstrijkje, dus gedeeltelijke verificatiebias zal afwezig zijn. De CLDC-test en nasofaryngeale uitstrijkjes zullen op hetzelfde moment worden uitgevoerd om ziekteprogressiebias te voorkomen. Omdat de CLCD-test en het nasofaryngeale uitstrijkje worden geanalyseerd door onafhankelijke geblindeerde clinici, wordt informatiebias vermeden bij het interpreteren van de PCR-resultaten van de uitstrijkjes. De indextest is volledig onafhankelijk van de referentietest, dus om de incorporatiebias te voorkomen. Onduidelijke resultaten worden geregistreerd.

Steekproefomvang en statistische analyse. De incidentie van positiviteit voor COVID-19 wordt momenteel geschat op 15% in de algemene bevolking en 20% bij mensen met een hoog risico. Daarom schat het tussen de 150 en 200 positieven te vinden in een populatie van 1000 proefpersonen met een verschillend risico op infectie.

Een steekproefomvang van 1000 met een prevalentie van 15% positieve nasofaryngeale uitstrijkjes zou voldoende zijn om een ​​sensitiviteit van ongeveer 0,75 te schatten met een precisie van 0,15 voor het 95% betrouwbaarheidsinterval en een macht van 0,8.

Demografische en klinische kenmerken van de in aanmerking komende deelnemers zullen worden samengevat door gebruik te maken van gemiddelde en standaardverhoudingen, of absolute en relatieve frequenties, voor respectievelijk continue en discrete variabelen. Uitsluitend voor beschrijvende doeleinden zullen dezelfde statistische analyses ook worden gerapporteerd bij proefpersonen met een positief en negatief nasofaryngeaal uitstrijkje. In geval van technisch falen van testen zonder de mogelijkheid om de procedure te herhalen, worden de deelnemers uitgesloten van verdere analyses. Bij de andere proefpersonen zullen de sensitiviteit en specificiteit voor de CLDC (indextest) in vergelijking met het nasofaryngeale uitstrijkje (referentietest 1) of FBC (referentietest 2) worden geschat, en hun 95%-betrouwbaarheidsinterval zal worden berekend op basis van de exacte binominale verdeling. Deze analyses zullen ook worden gerepliceerd op hoofdvakkenmerken. De deelnemers zullen worden gekarakteriseerd als echte positieven (TP), valse positieven (FP), evenals valse negatieven (FN) en echte negatieven (TN), in termen van prevalentie van positieve CLDC-PCR-, CLDC-FBC-resultaten. De nulassociatie van geen verschil tussen TP, FP, FN en TN wordt getest met behulp van een Kruskal-Wallis-test.