染色体结构重排和脑部疾病

项目描述 目标 1) 结构基因组变异形成的分子机制是什么？

我们已经拥有来自 500 多个个体 SV 的 WGS 数据。 为了了解潜在的突变和疾病机制，我们将结构变异检测与重排的位置信息结合起来。 这对于重复（重复基因组片段的位置是正确临床解释的关键）和复杂的重排尤其重要。 其次，将建立确切的断点并分析断点连接处的序列基序。

目标 2) 疾病病理学涉及的分子机制是什么？

首先，我们将使用全基因组测序来识别和表征结构变异。 接下来，为了了解受SV影响的候选疾病基因如何引起临床症状，我们将从三个方面研究疾病病理学中涉及的细胞机制：

第1部分。 原代细胞的体外研究：将通过 RT-PCR、qPCR 和蛋白质印迹在患者细胞（成纤维细胞或 B 细胞系）中评估对表达和剪接的影响。

第 2 部分：患者来源模型的体外研究：在选定的情况下，我们将产生诱导多能干细胞和神经祖细胞（NES 细胞），这将为直接研究来自患者的细胞中早期神经发生的影响提供机会。患者并与来自正常对照的细胞进行比较。 我们感兴趣的是使用 NES 细胞在 2D 培养中研究早期神经发生，以及在 3D 培养中直接从 iPS 细胞系生成另一种发育相关模型——脑类器官（迷你大脑）。 类器官 3D 培养概括了各个大脑区域的发育，因此是研究大脑疾病的独特工具。 此外，3D 神经培养可以提高细胞成熟度并刺激疾病表型的表达，从而有助于更好地了解疾病机制。

第 3 部分：斑马鱼模型的体内研究：斑马鱼（Danio rerio）是一种功能良好的体内系统，用于研究正常和异常胚胎发育。 通过 CRISPR/Cas9 诱导的基因破坏或吗啉敲低，RNA 过表达和缺失来模拟重复。 表型的评估是根据患者观察到的情况（例如头部大小、颅面缺陷、心血管畸形、纤毛缺陷）设计的。

目标 3) 结构基因组变异如何影响基因表达？

我们计划通过三种方式研究长期影响。 第1部分。 为了评估 TAD 中断的临床影响，我们将在来自临床遗传学阵列数据库（来自 6200 多名患有罕见 NDD 的儿童的数据）、LocusDB SV（通过 WGS 分析的超过 1000 名罕见疾病患者的 SV 调用）的 CNV 数据中搜索此类事件临床基因组学 SciLifeLab）和公开数据库（DECIPHER、ICCG 和 SWEGEN）。 生物信息学分析将结合 SV 周围已知疾病基因与患者特征之间的表型重叠信息，以及与组织特异性增强子和 TAD 区域的物理重叠信息。 新的计算方法将被设计用于发现被类似机制破坏的基因。 后续研究将涉及进一步的患者特征分析和定制 RNA 研究。

第 2 部分：通过 RNA-seq 对患者样本进行转录组分析。 由于并非每个基因在每个细胞中都具有转录活性，因此成功实现这一目标的关键是获取生物学相关的样本。 通常无法进行活检，因此在这些情况下，iPS 细胞是研究对 RNA 表达的生物学相关影响的另一种方法。 在具有配对 WGS 和 RNA-seq 数据的情况下，我们将整合转录水平和 ASE 的变化，作为 SV 对邻近基因影响的读数。

第 3 部分：细胞和动物研究：当原代细胞不可用时，将在人类细胞系中引入带有 CRISPR/Cas9 的特定 SV，并且根据目标 2 创建的斑马鱼系也可用于评估 SV 在生物体水平上的整体影响。