Структурные хромосомные перестройки и заболевания головного мозга

ОПИСАНИЕ ПРОЕКТА Цель 1) Каковы молекулярные механизмы формирования структурных вариантов генома?

У нас уже есть данные WGS от более чем 500 отдельных спутников. Чтобы понять основные механизмы мутаций и заболеваний, мы объединим обнаружение структурных вариантов с информацией о положении для перестройки. Это будет особенно важно для дупликаций (расположение дублированного геномного сегмента является ключом к правильной клинической интерпретации) и для сложных перестроек. Во-вторых, будет установлена ​​точная точка разрыва и проанализированы соединения точек разрыва на предмет мотивов последовательности.

Цель 2) Каковы молекулярные механизмы, участвующие в патологии заболевания?

Сначала мы будем использовать WGS для идентификации и характеристики структурных вариантов. Далее, чтобы понять, как гены-кандидаты заболевания, на которые влияют SV, вызывают клинические симптомы, мы изучим клеточные механизмы, участвующие в патологии заболевания, тремя способами:

Часть 1. Исследования первичных клеток in vitro: влияние на экспрессию и сплайсинг будет оцениваться на клетках пациента (фибробластах или линиях В-клеток) с помощью RT-PCR, qPCR и вестерн-блоттинга.

Часть 2. Исследования in vitro на моделях, полученных от пациентов. В отдельных случаях мы будем генерировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и нейральные клетки-предшественники (NES-клетки), что даст возможность напрямую изучать эффекты раннего нейрогенеза в клетках из пациента и сравнить с клетками, полученными из нормального контроля. Мы заинтересованы в изучении как раннего нейрогенеза в 2D-культуре с использованием клеток NES, так и в создании другой модели, соответствующей развитию, органоидов мозга (мини-мозга) в 3D-культуре непосредственно из клеточных линий iPS. 3D-культура органоидов воспроизводит развитие различных областей мозга и поэтому является уникальным инструментом для исследования заболеваний головного мозга. Кроме того, 3D-нейронная культура может улучшить зрелость клеток и стимулировать проявление фенотипов заболеваний, что будет способствовать лучшему пониманию механизмов заболевания.

Часть 3. Исследования in vivo на модели рыбки данио: Рыбка данио (Danio rerio) представляет собой хорошо функционирующую систему in vivo для изучения нормального и аномального эмбриологического развития. Дупликации моделируются сверхэкспрессией и делецией РНК посредством разрушения гена, индуцированного CRISPR/Cas9, или нокдауна морфолино. Оценка фенотипов проводится в соответствии с наблюдаемыми у пациентов (например, размер головы, черепно-лицевые дефекты, сердечно-сосудистые пороки развития, дефекты ресничек).

Цель 3) Как структурные варианты генома влияют на экспрессию генов?

Мы планируем изучать дальнодействующие эффекты тремя способами. Часть 1. Чтобы оценить клиническое влияние сбоев TAD, мы будем искать такие события в данных CNV из базы данных массива Clinical Genetics (данные более чем 6200 детей с редкими NDD), LocusDB SV (вызовы SV от > 1000 пациентов с редкими заболеваниями, проанализированные WGS). в Clinical Genomics SciLifeLab) и общедоступных базах данных (DECIPHER, ICCG и SWEGEN). Биоинформатический анализ объединит информацию о фенотипическом совпадении между генами известных заболеваний, окружающими SV, и характеристиками пациентов, а также о физическом совпадении с тканеспецифичными энхансерами и областями TAD. Новые вычислительные подходы будут разработаны для обнаружения генов, разрушенных аналогичными механизмами. Последующие исследования будут включать дальнейшую характеристику пациентов и индивидуальные исследования РНК.

Часть 2. Транскриптомный анализ образцов пациентов проводится методом RNA-seq. Поскольку не каждый ген транскрипционно активен в каждой клетке, ключом к успешному достижению этой цели является доступ к биологически значимым образцам. Биопсия часто недоступна, поэтому в таких случаях iPS-клетки являются альтернативным способом изучения биологически значимого воздействия на экспрессию РНК. В случаях с парными данными WGS и RNA-seq мы будем интегрировать изменения в уровнях транскрипции и ASE как показатель влияния SV на соседние гены.

Часть 3. Исследования на клетках и животных: Введение специфических SV с CRISPR/Cas9 в клеточные линии человека будет осуществляться, когда первичные клетки недоступны, а линии рыбок данио, созданные в рамках цели 2, также могут использоваться для оценки глобального воздействия SV на уровне организма. .