Strukturelle kromosomomlejringer og hjernesygdomme

PROJEKTBESKRIVELSE Formål 1) Hvad er de molekylære mekanismer for dannelse af strukturelle genomiske varianter?

Vi har allerede WGS-data fra mere end 500 individuelle SV'er. For at forstå de underliggende mutations- og sygdomsmekanismer vil vi kombinere strukturel variantdetektion med positionsinformation til omarrangeringen. Dette vil være særligt vigtigt for duplikationer (placeringen af ​​det duplikerede genomiske segment er nøglen til en korrekt klinisk fortolkning) og for komplekse omarrangementer. For det andet vil det nøjagtige brudpunkt blive etableret og brudpunktsforbindelser analyseret for sekvensmotiver.

Mål 2) Hvad er de molekylære mekanismer involveret i sygdomspatologi?

Først vil vi bruge WGS til at identificere og karakterisere strukturelle varianter. Dernæst vil vi studere de cellulære mekanismer, der er involveret i sygdomspatologi på tre måder, for at forstå, hvordan kandidatsygdomsgenerne, der er påvirket af SV'erne, forårsager kliniske symptomer:

Del 1. In vitro undersøgelser af primære celler: Effekter på ekspression og splejsning vil blive evalueret i patientceller (fibroblaster eller B-cellelinjer) med RT-PCR, qPCR og Western blot.

Del 2. In vitro undersøgelser i patient-afledte modeller: I udvalgte tilfælde vil vi generere inducerede-pluripotente stamceller og neurale progenitorceller (NES-celler), som vil give mulighed for direkte at studere virkningerne af tidlig neurogenese i celler fra patient og sammenligne med celler afledt af normale kontroller. Vi er interesserede i at studere både tidlig neurogenese i 2D-kultur ved hjælp af NES-cellerne, samt at generere en anden udviklingsrelevant model, hjerneorganoider (mini-hjerne), i 3D-kultur direkte fra iPS-cellelinjer. Organoid 3D-kultur rekapitulerer udviklingen af ​​forskellige hjerneregioner og er derfor et unikt værktøj til at undersøge hjernesygdomme. Desuden kunne 3D-neuralkulturen forbedre cellemodenhed og stimulere ekspression af sygdomsfænotyper, der letter en bedre forståelse af sygdomsmekanismerne.

Del 3. In vivo undersøgelser i en zebrafisk model: Zebrafisk (Danio rerio) er et velfungerende in vivo system til undersøgelser af normal og abnorm embryologisk udvikling. Duplikationer simuleres ved RNA-overekspression og deletion gennem CRISPR/Cas9-induceret genafbrydelse eller morpholino-knock-down. Vurdering af fænotyperne er designet i overensstemmelse med dem, der observeres hos patienter (fx hovedstørrelse, kraniofaciale defekter, kardiovaskulære misdannelser, cilia-defekter).

Formål 3) Hvordan påvirker strukturelle genomiske varianter genekspression?

Vi planlægger at studere langdistanceeffekter på tre måder. Del 1. For at vurdere den kliniske effekt af TAD-forstyrrelser vil vi søge efter sådanne hændelser i CNV-dataene fra Clinical Genetics array-databasen (data fra over 6200 børn med sjældne NDD'er), LocusDB SV (SV-opkald fra >1000 patienter med sjældne sygdomme analyseret af WGS på Clinical Genomics SciLifeLab) og offentligt tilgængelige databaser (DECIPHER, ICCG og SWEGEN). Den bioinformatiske analyse vil kombinere information om fænotypisk overlap mellem kendte sygdomsgener omkring SV og patienternes karakteristika, samt om fysisk overlap med vævsspecifikke forstærkere og TAD-regioner. Nye beregningsmetoder vil blive designet til opdagelsen af ​​gener forstyrret af lignende mekanismer. Opfølgningsundersøgelser vil involvere yderligere patientkarakterisering og tilpassede RNA-undersøgelser.

Del 2. Transkriptomanalyse af patientprøver udføres ved RNA-seq. Da ikke alle gener er transkriptionelt aktive i hver celle, er en nøgle til succesfuld opnåelse af dette mål adgang til biologisk relevante prøver. Ofte er biopsier ikke tilgængelige, derfor er iPS-celler i disse tilfælde en alternativ måde at studere biologisk relevante effekter på RNA-ekspression. I tilfælde med parrede WGS- og RNA-seq-data vil vi integrere ændringer i transkriptionsniveauer og ASE som en udlæsning for SVs-effekten på nabogener.

Del 3. Celle- og dyreforsøg: Introduktion af specifikke SV'er med CRISPR/Cas9 i humane cellelinjer vil blive udført, når de primære celler er utilgængelige, og zebrafiskelinjer skabt under mål 2 kan også bruges til at evaluere globale effekter af SV'er på organismeniveau .