Réarrangements chromosomiques structurels et troubles cérébraux

DESCRIPTION DU PROJET Objectif 1) Quels sont les mécanismes moléculaires de formation des variants génomiques structurels ?

Nous disposons déjà de données WGS provenant de plus de 500 SV individuels. Pour comprendre les mécanismes mutationnels et pathologiques sous-jacents, nous combinerons la détection de variantes structurelles avec des informations de position pour le réarrangement. Cela sera particulièrement important pour les duplications (la localisation du segment génomique dupliqué est la clé d’une interprétation clinique correcte) et pour les réarrangements complexes. Deuxièmement, le point de rupture exact sera établi et les jonctions des points de rupture analysées pour les motifs de séquence.

Objectif 2) Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans la pathologie de la maladie ?

Nous utiliserons d’abord WGS pour identifier et caractériser les variantes structurelles. Ensuite, pour comprendre comment le ou les gènes candidats affectés par les SV provoquent des symptômes cliniques, nous étudierons les mécanismes cellulaires impliqués dans la pathologie de la maladie de trois manières :

Partie 1. Études in vitro de cellules primaires : Les effets sur l'expression et l'épissage seront évalués dans les cellules de patients (fibroblastes ou lignées de cellules B) par RT-PCR, qPCR et Western blot.

Partie 2. Études in vitro sur des modèles dérivés de patients : Dans des cas sélectionnés, nous générerons des cellules souches pluripotentes induites et des cellules progénitrices neurales (cellules NES), ce qui permettra d'étudier directement les effets de la neurogenèse précoce dans les cellules du patient et comparer aux cellules dérivées de contrôles normaux. Nous souhaitons étudier à la fois la neurogenèse précoce en culture 2D à l'aide des cellules NES, ainsi que la génération d'un autre modèle pertinent sur le plan du développement, les organoïdes cérébraux (mini-cerveaux), en culture 3D directement à partir de lignées cellulaires iPS. La culture organoïde 3D récapitule le développement de diverses régions du cerveau et constitue donc un outil unique pour étudier les troubles cérébraux. De plus, la culture neuronale 3D pourrait améliorer la maturité cellulaire et stimuler l’expression de phénotypes de maladies facilitant une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie.

Partie 3. Études in vivo sur un modèle de poisson zèbre : Le poisson zèbre (Danio rerio) est un système in vivo qui fonctionne bien pour les études du développement embryonnaire normal et anormal. Les duplications sont simulées par la surexpression et la suppression de l'ARN via une perturbation génique induite par CRISPR/Cas9 ou un knock-down morpholino. L'évaluation des phénotypes est conçue en fonction de ceux observés chez les patients (par exemple taille de la tête, défauts cranio-faciaux, malformations cardiovasculaires, défauts cils).

Objectif 3) Quel est l'impact des variantes génomiques structurelles sur l'expression des gènes ?

Nous prévoyons d’étudier les effets à long terme de trois manières. Partie 1. Pour évaluer l'impact clinique des perturbations du TAD, nous rechercherons de tels événements dans les données CNV de la base de données Clinical Genetics array (données de plus de 6 200 enfants atteints de NDD rares), LocusDB SV (appels SV de > 1 000 patients atteints de maladies rares analysés par WGS at Clinical Genomics SciLifeLab) et des bases de données accessibles au public (DECIPHER, ICCG et SWEGEN). L'analyse bioinformatique combinera des informations sur le chevauchement phénotypique entre les gènes de maladies connus entourant la SV et les caractéristiques des patients, ainsi que sur le chevauchement physique avec les amplificateurs spécifiques aux tissus et les régions TAD. De nouvelles approches informatiques seront conçues pour la découverte de gènes perturbés par des mécanismes similaires. Les études de suivi impliqueront une caractérisation plus approfondie des patients et des études personnalisées sur l'ARN.

Partie 2. L'analyse du transcriptome des échantillons de patients est effectuée par RNA-seq. Étant donné que tous les gènes ne sont pas actifs sur le plan transcriptionnel dans chaque cellule, l’accès à des échantillons biologiquement pertinents est essentiel pour atteindre cet objectif. Souvent, les biopsies ne sont pas disponibles et, dans ces cas-là, les cellules iPS constituent un moyen alternatif d'étudier les effets biologiquement pertinents sur l'expression de l'ARN. Dans les cas de données WGS et RNA-seq appariées, nous intégrerons les changements dans les niveaux de transcription et l'ASE comme lecture de l'effet des SV sur les gènes voisins.

Partie 3. Études cellulaires et animales : l'introduction de SV spécifiques avec CRISPR/Cas9 dans les lignées cellulaires humaines sera effectuée lorsque les cellules primaires ne sont pas disponibles et que les lignées de poisson zèbre créées dans le cadre de l'objectif 2 pourront également être utilisées pour évaluer les effets globaux des SV au niveau de l'organisme. .