Strukturális kromoszóma-átrendeződések és agyi rendellenességek

A PROJEKT LEÍRÁSA Cél 1) Melyek a szerkezeti genomi variánsok kialakulásának molekuláris mechanizmusai?

Már több mint 500 egyedi SV-ről rendelkezünk WGS-adatokkal. A mögöttes mutációs és betegségmechanizmusok megértéséhez kombináljuk a szerkezeti variánsok kimutatását a helyzetinformációkkal az átrendeződéshez. Ez különösen fontos lesz a duplikációk (a megkettőzött genomiális szegmens elhelyezkedése kulcsfontosságú a helyes klinikai értelmezés szempontjából) és összetett átrendeződések esetén. Másodszor, meg kell határozni a pontos töréspontot, és elemezni kell a töréspont csomópontokat a szekvencia-motívumok szempontjából.

Cél 2) Milyen molekuláris mechanizmusok vesznek részt a betegség patológiájában?

Először a WGS-t fogjuk használni a szerkezeti változatok azonosítására és jellemzésére. Ezután annak megértéséhez, hogy az SV-k által érintett jelölt betegséggén(ek) hogyan okoznak klinikai tüneteket, háromféleképpen tanulmányozzuk a betegség patológiájában szerepet játszó sejtmechanizmusokat:

1. rész. Primer sejtek in vitro vizsgálata: Az expresszióra és a splicingre gyakorolt ​​hatást a páciens sejtjeiben (fibroblasztokban vagy B-sejtvonalakban) RT-PCR-rel, qPCR-rel és Western blot-tal értékeljük.

2. rész. In vitro vizsgálatok betegeredetű modelleken: Kiválasztott esetekben indukált pluripotens őssejteket és idegi progenitor sejteket (NES sejtek) generálunk, amelyek lehetőséget adnak a korai neurogenezis hatásainak közvetlen tanulmányozására és hasonlítsa össze a normál kontrollokból származó sejtekkel. Mind a korai neurogenezis tanulmányozása 2D tenyészetben a NES-sejtek felhasználásával, mind pedig egy másik, a fejlődés szempontjából releváns modell, az agyi organoidok (mini agyak) létrehozása 3D tenyészetben, közvetlenül iPS sejtvonalakból. Az organoid 3D kultúra összefoglalja a különböző agyi régiók fejlődését, ezért egyedülálló eszköz az agyi rendellenességek vizsgálatára. Ezenkívül a 3D neurális kultúra javíthatja a sejtek érettségét és serkentheti a betegség fenotípusainak expresszióját, ami megkönnyíti a betegség mechanizmusainak jobb megértését.

3. rész. In vivo vizsgálatok zebrahal modellben: A zebrahal (Danio rerio) egy jól működő in vivo rendszer a normál és abnormális embriológiai fejlődés tanulmányozására. A megkettőződéseket az RNS túlzott expressziója és deléciója szimulálja a CRISPR/Cas9 által kiváltott génszakadás vagy morfolino leütés révén. A fenotípusok értékelése a betegeknél megfigyeltekkel összhangban történik (pl. fejméret, koponya-faciális defektusok, kardiovaszkuláris rendellenességek, csillók defektusai).

3. cél) Hogyan befolyásolják a strukturális genomi variánsok a génexpressziót?

Háromféle módon tervezzük tanulmányozni a hosszú távú hatásokat. 1. rész. A TAD-megszakítások klinikai hatásának felméréséhez az ilyen eseményeket a Clinical Genetics array adatbázis CNV-adatai között fogjuk keresni (több mint 6200 ritka NDD-s gyermek adatai), a LocusDB SV-ben (a WGS által elemzett több mint 1000 ritka betegségben szenvedő beteg SV-hívásai) a Clinical Genomics SciLifeLab) és a nyilvánosan elérhető adatbázisok (DECIPHER, ICCG és SWEGEN). A bioinformatikai elemzés egyesíti az SV-t körülvevő ismert betegséggének közötti fenotípusos átfedéseket és a betegek jellemzőit, valamint a szövetspecifikus enhanszerekkel és a TAD régiókkal való fizikai átfedést. Új számítási megközelítéseket terveznek a hasonló mechanizmusok által megzavart gének felfedezésére. A nyomon követési vizsgálatok további betegjellemzést és testreszabott RNS-vizsgálatokat foglalnak magukban.

2. rész. A betegminták transzkriptomanalízise RNS-seq. Mivel nem minden gén transzkripciósan aktív minden sejtben, e cél sikeres elérésének kulcsa a biológiailag releváns mintákhoz való hozzáférés. A biopsziák gyakran nem állnak rendelkezésre, ezért ilyen esetekben az iPS-sejtek alternatív módszert jelentenek az RNS-expresszióra gyakorolt ​​biológiailag releváns hatások tanulmányozására. Párosított WGS és RNS-seq adatok esetén integráljuk a transzkripciós szintek és az ASE változásait a szomszédos génekre gyakorolt ​​​​SV-hatások kiolvasásaként.

3. rész. Sejt- és állatkísérletek: Speciális SV-k CRISPR/Cas9-cel történő bejuttatására emberi sejtvonalakba akkor kerül sor, amikor az elsődleges sejtek nem állnak rendelkezésre, és a 2. cél szerint létrehozott zebradán vonalak szintén felhasználhatók az SV-k szervezeti szintű globális hatásainak értékelésére. .