구조적 염색체 재배열 및 뇌 장애

프로젝트 설명 목표 1) 구조적 게놈 변이체 형성의 분자 메커니즘은 무엇입니까?

우리는 이미 500개가 넘는 개별 SV의 WGS 데이터를 보유하고 있습니다. 기본 돌연변이 및 질병 메커니즘을 이해하기 위해 구조적 변형 감지와 재배열을 위한 위치 정보를 결합합니다. 이는 중복(복제된 게놈 세그먼트의 위치가 올바른 임상 해석의 핵심) 및 복잡한 재배열의 경우 특히 중요합니다. 둘째, 정확한 중단점이 설정되고 중단점 접합이 서열 모티프에 대해 분석됩니다.

목표 2) 질병 병리와 관련된 분자 메커니즘은 무엇입니까?

먼저 WGS를 사용하여 구조적 변형을 식별하고 특성화합니다. 다음으로 SV에 의해 영향을 받는 후보 질병 유전자가 어떻게 임상 증상을 유발하는지 이해하기 위해 질병 병리와 관련된 세포 메커니즘을 세 가지 방법으로 연구합니다.

1 부. 일차 세포에 대한 시험관 내 연구: 발현 및 접합에 대한 효과는 RT-PCR, qPCR 및 웨스턴 블롯을 사용하여 환자 세포(섬유아세포 또는 B 세포주)에서 평가됩니다.

2부. 환자 유래 모델을 이용한 시험관 내 연구: 선택된 사례에서 우리는 유도만능줄기세포와 신경전구세포(NES 세포)를 생성할 것입니다. 환자를 대상으로 하고 정상 대조군에서 유래된 세포와 비교합니다. 우리는 NES 세포를 사용하여 2D 배양에서 초기 신경 발생을 연구하는 것뿐만 아니라 iPS 세포주에서 직접 3D 배양으로 또 다른 발달 관련 모델인 뇌 오르가노이드(미니 두뇌)를 생성하는 데 관심이 있습니다. 오가노이드 3D 문화는 다양한 뇌 영역의 발달을 요약하므로 뇌 장애를 조사하는 독특한 도구입니다. 또한, 3D 신경 배양은 세포 성숙도를 향상시키고 질병 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이 되는 질병 표현형의 발현을 자극할 수 있습니다.

3부. 제브라피시 모델의 생체 내 연구: Zebrafish(Danio rerio)는 정상 및 비정상 배아 발달 연구를 위한 잘 작동하는 생체 내 시스템입니다. 복제는 CRISPR/Cas9 유도 유전자 파괴 또는 모르폴리노 녹다운을 통한 RNA 과발현 및 결실에 의해 시뮬레이션됩니다. 표현형의 평가는 환자에게서 관찰된 것(예: 머리 크기, 두개안면 결함, 심혈관 기형, 섬모 결함)에 따라 설계되었습니다.

목표 3) 구조적 게놈 변이가 유전자 발현에 어떤 영향을 미치나요?

우리는 세 가지 방법으로 장거리 효과를 연구할 계획입니다. 1 부. TAD 중단의 임상적 영향을 평가하기 위해 우리는 Clinical Genetics 배열 데이터베이스(희귀 NDD가 있는 6200명 이상의 어린이로부터 얻은 데이터), LocusDB SV(WGS에서 분석한 희귀 질환이 있는 1000명 이상의 환자로부터의 SV 호출)의 CNV 데이터에서 그러한 이벤트를 검색할 것입니다. Clinical Genomics SciLifeLab) 및 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스(DECIPHER, ICCG 및 SWEGEN). 생물정보학 분석은 SV 주변의 알려진 질병 유전자와 환자 특성 간의 표현형 중복에 대한 정보뿐만 아니라 조직 특이적 인핸서 및 TAD 영역과의 물리적 중복에 대한 정보를 결합합니다. 유사한 메커니즘에 의해 파괴된 유전자를 발견하기 위해 새로운 컴퓨터 접근 방식이 설계될 것입니다. 후속 연구에는 추가 환자 특성화 및 맞춤형 RNA 연구가 포함될 것입니다.

파트 2. 환자 샘플의 전사체 분석은 RNA-seq로 수행됩니다. 모든 유전자가 모든 세포에서 전사적으로 활성화되는 것은 아니기 때문에 이 목표를 성공적으로 달성하는 열쇠는 생물학적으로 관련된 샘플에 접근하는 것입니다. 종종 생검을 이용할 수 없기 때문에 이러한 경우 iPS 세포는 RNA 발현에 대한 생물학적 관련 효과를 연구하는 대체 방법입니다. WGS와 RNA-seq 데이터가 쌍을 이루는 경우 전사 수준과 ASE의 변화를 이웃 유전자에 대한 SV 효과에 대한 판독값으로 통합합니다.

3부. 세포 및 동물 연구: 일차 세포를 사용할 수 없을 때 인간 세포주에 CRISPR/Cas9가 포함된 특정 SV를 도입하고 목표 2에 따라 생성된 제브라피시 계통을 사용하여 유기체 수준에 대한 SV의 전반적인 영향을 평가할 수도 있습니다. .