Rakenteelliset kromosomien uudelleenjärjestelyt ja aivojen häiriöt

PROJEKTIN KUVAUS Tavoite 1) Mitkä ovat rakenteellisten genomisten muunnelmien muodostumismekanismit?

Meillä on jo WGS-tietoja yli 500 yksittäisestä SV:stä. Ymmärtääksemme taustalla olevia mutaatio- ja sairausmekanismeja yhdistämme rakenteellisen muunnelman havaitsemisen paikkatietoon uudelleenjärjestelyä varten. Tämä on erityisen tärkeää päällekkäisyyksissä (kaksoistetun genomisen segmentin sijainti on avain oikean kliinisen tulkinnan kannalta) ja monimutkaisille uudelleenjärjestelyille. Toiseksi määritetään tarkka katkaisupiste ja katkaisupisteiden liitokset analysoidaan sekvenssimotiivien varalta.

Tavoite 2) Mitkä ovat sairauden patologiaan liittyvät molekyylimekanismit?

Ensin käytämme WGS:ää rakenteellisten varianttien tunnistamiseen ja karakterisoimiseen. Ymmärtääksemme seuraavaksi, kuinka SV:iden vaikuttama ehdokastautigeeni(t) aiheuttavat kliinisiä oireita, tutkimme sairauden patologiaan osallistuvia solumekanismeja kolmella tavalla:

Osa 1. Primäärisolujen in vitro -tutkimukset: Vaikutukset ekspressioon ja silmukointiin arvioidaan potilassoluissa (fibroblastit tai B-solulinjat) RT-PCR:llä, qPCR:llä ja Western blotilla.

Osa 2. In vitro -tutkimukset potilasperäisissä malleissa: Valituissa tapauksissa tuotamme indusoituja pluripotentteja kantasoluja ja hermosolujen esisoluja (NES-soluja), jotka tarjoavat mahdollisuuden suoraan tutkia varhaisen neurogeneesin vaikutuksia soluissa potilaalle ja verrata soluihin, jotka on saatu normaaleista kontrolleista. Olemme kiinnostuneita sekä varhaisen neurogeneesin tutkimisesta 2D-viljelmässä NES-solujen avulla että toisen kehityksen kannalta merkityksellisen mallin, aivojen organoidien (miniaivot), luomisesta 3D-viljelmässä suoraan iPS-solulinjoista. Organoidi 3D -viljelmä kuvaa eri aivoalueiden kehitystä ja on siksi ainutlaatuinen työkalu aivosairauksien tutkimiseen. Lisäksi 3D-hermoviljelmä voisi parantaa solujen kypsyyttä ja stimuloida sairauden fenotyyppien ilmentymistä, mikä helpottaa sairauden mekanismien parempaa ymmärtämistä.

Osa 3. In vivo -tutkimukset seeprakalamallissa: Seeprakala (Danio rerio) on hyvin toimiva in vivo -järjestelmä normaalin ja epänormaalin alkionkehityksen tutkimuksiin. Päällekkäisyyksiä simuloidaan RNA:n yli-ilmentymisellä ja deleetiolla CRISPR/Cas9-indusoidun geenihäiriön tai morfolinon kaatumisen kautta. Fenotyyppien arviointi suunnitellaan potilailla havaittujen (esim. pään koko, kallon ja kasvojen vauriot, sydän- ja verisuonitautien epämuodostumat, värekarvojen vauriot) mukaisesti.

Tavoite 3) Miten rakenteelliset genomiset variantit vaikuttavat geenien ilmentymiseen?

Aiomme tutkia pitkän kantaman vaikutuksia kolmella tavalla. Osa 1. TAD-häiriöiden kliinisen vaikutuksen arvioimiseksi etsimme tällaisia ​​tapahtumia CNV-tiedoista Clinical Genetics array -tietokannasta (tiedot yli 6200 lapsesta, joilla on harvinainen NDD) ja LocusDB SV (SV-puhelut > 1000 harvinaista sairautta sairastavalta potilaalta WGS:n analysoimalla Clinical Genomics SciLifeLab) ja julkisesti saatavilla oleviin tietokantoihin (DECIPHER, ICCG ja SWEGEN). Bioinformaattinen analyysi yhdistää tiedot SV:tä ympäröivien tunnettujen sairausgeenien fenotyyppisestä päällekkäisyydestä ja potilaiden ominaisuuksista sekä fyysisestä päällekkäisyydestä kudosspesifisten tehostajien ja TAD-alueiden kanssa. Uusia laskennallisia lähestymistapoja suunnitellaan samanlaisten mekanismien häiritsemien geenien löytämiseen. Seurantatutkimukset sisältävät lisää potilaan karakterisointia ja räätälöityjä RNA-tutkimuksia.

Osa 2. Potilasnäytteiden transkriptioanalyysi tehdään RNA-seq. Koska kaikki geenit eivät ole transkriptionaalisesti aktiivisia jokaisessa solussa, avain tämän tavoitteen menestyksekkääseen saavuttamiseen on pääsy biologisesti merkityksellisiin näytteisiin. Usein biopsiat eivät ole saatavilla, joten näissä tapauksissa iPS-solut ovat vaihtoehtoinen tapa tutkia biologisesti merkittäviä vaikutuksia RNA:n ilmentymiseen. Tapauksissa, joissa on parillinen WGS- ja RNA-seq-data, integroimme muutokset transkriptiotasoissa ja ASE:ssa lukemaan SV:n vaikutusta viereisiin geeneihin.

Osa 3. Solu- ja eläintutkimukset: Tietyt SV:t CRISPR/Cas9:llä tuodaan ihmisen solulinjoihin, kun primaarisolut eivät ole käytettävissä, ja tavoitteen 2 mukaisesti luotuja seeprakalalinjoja voidaan myös käyttää arvioimaan SV:iden globaaleja vaikutuksia organismitasolla .