Riarrangiamenti cromosomici strutturali e disturbi cerebrali

DESCRIZIONE DEL PROGETTO Obiettivo 1) Quali sono i meccanismi molecolari di formazione delle varianti genomiche strutturali?

Disponiamo già di dati WGS di oltre 500 singoli SV. Per comprendere i meccanismi mutazionali e patologici sottostanti, combineremo il rilevamento delle varianti strutturali con le informazioni posizionali per il riarrangiamento. Ciò sarà particolarmente importante per le duplicazioni (la localizzazione del segmento genomico duplicato è fondamentale per una corretta interpretazione clinica) e per i riarrangiamenti complessi. In secondo luogo, verrà stabilito l'esatto punto di interruzione e verranno analizzate le giunzioni dei punti di interruzione per motivi di sequenza.

Obiettivo 2) Quali sono i meccanismi molecolari coinvolti nella patologia della malattia?

Per prima cosa utilizzeremo il WGS per identificare e caratterizzare le varianti strutturali. Successivamente, per comprendere come i geni candidati alla malattia colpiti dalle SV causino sintomi clinici, studieremo i meccanismi cellulari coinvolti nella patologia della malattia in tre modi:

Parte 1. Studi in vitro su cellule primarie: gli effetti sull'espressione e sullo splicing saranno valutati nelle cellule dei pazienti (fibroblasti o linee cellulari B) mediante RT-PCR, qPCR e Western blot.

Parte 2. Studi in vitro in modelli derivati ​​dai pazienti: in casi selezionati, genereremo cellule staminali pluripotenti indotte e cellule progenitrici neurali (cellule NES), che forniranno l'opportunità di studiare direttamente gli effetti della neurogenesi precoce nelle cellule del paziente e confrontare con cellule derivate da controlli normali. Siamo interessati a studiare sia la neurogenesi precoce nella coltura 2D utilizzando le cellule NES, sia a generare un altro modello rilevante per lo sviluppo, gli organoidi cerebrali (mini cervelli), nella coltura 3D direttamente dalle linee cellulari iPS. La cultura 3D organoide riepiloga lo sviluppo di varie regioni del cervello ed è quindi uno strumento unico per studiare i disturbi cerebrali. Inoltre, la coltura neurale 3D potrebbe migliorare la maturità cellulare e stimolare l’espressione di fenotipi della malattia che facilitano una migliore comprensione dei meccanismi della malattia.

Parte 3. Studi in vivo in un modello di pesce zebra: Zebrafish (Danio rerio) è un sistema in vivo ben funzionante per studi sullo sviluppo embriologico normale e anormale. Le duplicazioni vengono simulate mediante sovraespressione e delezione dell'RNA attraverso la distruzione del gene indotta da CRISPR/Cas9 o l'abbattimento del morfolino. La valutazione dei fenotipi viene progettata in base a quelli osservati nei pazienti (ad es. dimensione della testa, difetti craniofacciali, malformazioni cardiovascolari, difetti delle ciglia).

Obiettivo 3) In che modo le varianti genomiche strutturali influenzano l'espressione genica?

Progettiamo di studiare gli effetti a lungo termine in tre modi. Parte 1. Per valutare l'impatto clinico delle interruzioni del TAD cercheremo tali eventi nei dati CNV dal database Clinical Genetics array (dati di oltre 6200 bambini con NDD rari), LocusDB SV (chiamate SV da >1000 pazienti con malattie rare analizzati da WGS presso Clinical Genomics SciLifeLab) e database disponibili al pubblico (DECIPHER, ICCG e SWEGEN). L'analisi bioinformatica combinerà le informazioni sulla sovrapposizione fenotipica tra i geni della malattia nota che circondano la SV e le caratteristiche dei pazienti, nonché sulla sovrapposizione fisica con potenziatori tessuto-specifici e regioni TAD. Verranno progettati nuovi approcci computazionali per la scoperta di geni alterati da meccanismi simili. Gli studi di follow-up comporteranno un'ulteriore caratterizzazione dei pazienti e studi personalizzati sull'RNA.

Parte 2. L'analisi del trascrittoma dei campioni dei pazienti viene eseguita mediante RNA-seq. Poiché non tutti i geni sono trascrizionalmente attivi in ​​ogni cellula, la chiave per raggiungere con successo questo obiettivo è l'accesso a campioni biologicamente rilevanti. Spesso le biopsie non sono disponibili quindi, in questi casi, le cellule iPS rappresentano un modo alternativo per studiare effetti biologicamente rilevanti sull'espressione dell'RNA. Nei casi con dati WGS e RNA-seq accoppiati, integreremo i cambiamenti nei livelli di trascrizione e ASE come lettura dell'effetto SV sui geni vicini.

Parte 3. Studi su cellule e animali: l'introduzione di SV specifici con CRISPR/Cas9 nelle linee cellulari umane verrà effettuata quando le cellule primarie non saranno disponibili e le linee di pesce zebra create nell'ambito dell'obiettivo 2 potranno essere utilizzate anche per valutare gli effetti globali degli SV a livello di organismo .