Reordenamientos cromosómicos estructurales y trastornos cerebrales

DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO Objetivo 1) ¿Cuáles son los mecanismos moleculares de formación de variantes genómicas estructurales?

Ya tenemos datos WGS de más de 500 SV individuales. Para comprender los mecanismos mutacionales y de enfermedad subyacentes, combinaremos la detección de variantes estructurales con información posicional para el reordenamiento. Esto será particularmente importante para las duplicaciones (la ubicación del segmento genómico duplicado es clave para una interpretación clínica correcta) y para los reordenamientos complejos. En segundo lugar, se establecerá el punto de interrupción exacto y se analizarán las uniones de los puntos de interrupción en busca de motivos de secuencia.

Objetivo 2) ¿Cuáles son los mecanismos moleculares implicados en la patología de la enfermedad?

Primero usaremos WGS para identificar y caracterizar variantes estructurales. A continuación, para comprender cómo los genes candidatos de la enfermedad afectados por los SV causan síntomas clínicos, estudiaremos los mecanismos celulares involucrados en la patología de la enfermedad de tres maneras:

Parte 1. Estudios in vitro de células primarias: los efectos sobre la expresión y el empalme se evaluarán en células del paciente (fibroblastos o líneas de células B) con RT-PCR, qPCR y Western blot.

Parte 2. Estudios in vitro en modelos derivados de pacientes: en casos seleccionados, generaremos células madre pluripotentes inducidas y células progenitoras neurales (células NES), que brindarán la oportunidad de estudiar directamente los efectos de la neurogénesis temprana en células del paciente y comparar con células derivadas de controles normales. Estamos interesados ​​en estudiar tanto la neurogénesis temprana en cultivos 2D utilizando células NES, como también generar otro modelo relevante para el desarrollo, organoides cerebrales (minicerebros), en cultivos 3D directamente a partir de líneas celulares iPS. El cultivo organoide en 3D recapitula el desarrollo de varias regiones del cerebro y, por lo tanto, es una herramienta única para investigar los trastornos cerebrales. Además, el cultivo neuronal 3D podría mejorar la madurez celular y estimular la expresión de fenotipos de enfermedades que faciliten una mejor comprensión de los mecanismos de la enfermedad.

Parte 3. Estudios in vivo en un modelo de pez cebra: El pez cebra (Danio rerio) es un sistema in vivo que funciona bien para estudios de desarrollo embriológico normal y anormal. Las duplicaciones se simulan mediante sobreexpresión y eliminación de ARN mediante alteración genética inducida por CRISPR/Cas9 o eliminación de morfolino. La evaluación de los fenotipos se diseña de acuerdo con los observados en los pacientes (por ejemplo, tamaño de la cabeza, defectos craneofaciales, malformaciones cardiovasculares, defectos de los cilios).

Objetivo 3) ¿Cómo afectan las variantes genómicas estructurales a la expresión genética?

Planeamos estudiar los efectos a largo plazo de tres maneras. Parte 1. Para evaluar el impacto clínico de las interrupciones de TAD, buscaremos dichos eventos en los datos CNV de la base de datos de Clinical Genetics (datos de más de 6200 niños con NDD raras), LocusDB SV (llamadas SV de> 1000 pacientes con enfermedades raras analizadas por WGS en Clinical Genomics SciLifeLab) y bases de datos disponibles públicamente (DECIPHER, ICCG y SWEGEN). El análisis bioinformático combinará información sobre la superposición fenotípica entre genes de enfermedades conocidas que rodean el SV y las características de los pacientes, así como sobre la superposición física con potenciadores específicos de tejido y regiones TAD. Se diseñarán nuevos enfoques computacionales para descubrir genes alterados por mecanismos similares. Los estudios de seguimiento implicarán una mayor caracterización de los pacientes y estudios de ARN personalizados.

Parte 2. El análisis del transcriptoma de muestras de pacientes se realiza mediante RNA-seq. Dado que no todos los genes son transcripcionalmente activos en todas las células, una clave para lograr este objetivo con éxito es el acceso a muestras biológicamente relevantes. A menudo las biopsias no están disponibles, por lo que, en esos casos, las células iPS son una forma alternativa de estudiar efectos biológicamente relevantes sobre la expresión del ARN. En los casos con datos WGS y RNA-seq emparejados, integraremos cambios en los niveles de transcripción y ASE como una lectura del efecto de los SV en los genes vecinos.

Parte 3. Estudios en células y animales: la introducción de SV específicos con CRISPR/Cas9 en líneas celulares humanas se realizará cuando las células primarias no estén disponibles y las líneas de pez cebra creadas bajo el objetivo 2 también se podrán usar para evaluar los efectos globales de los SV a nivel de organismo. .