Strukturální přeuspořádání chromozomů a mozkové poruchy

POPIS PROJEKTU Cíl 1) Jaké jsou molekulární mechanismy tvorby strukturních genomických variant?

Již máme data WGS od více než 500 jednotlivých SV. Abychom porozuměli základním mutačním a chorobným mechanismům, zkombinujeme detekci strukturálních variant s pozičními informacemi pro přeuspořádání. To bude zvláště důležité pro duplikace (umístění duplikovaného genomového segmentu je klíčem ke správné klinické interpretaci) a pro komplexní přestavby. Za druhé, bude stanoven přesný bod zlomu a spoje bodu zlomu budou analyzovány na sekvenční motivy.

Cíl 2) Jaké molekulární mechanismy se podílejí na patologii onemocnění?

Nejprve použijeme WGS k identifikaci a charakterizaci strukturálních variant. Dále, abychom pochopili, jak kandidátský gen (geny) postižený SV způsobuje klinické příznaky, budeme studovat buněčné mechanismy zapojené do patologie onemocnění třemi způsoby:

Část 1. In vitro studie primárních buněk: Účinky na expresi a sestřih budou hodnoceny na buňkách pacienta (fibroblasty nebo B buněčné linie) pomocí RT-PCR, qPCR a Western blot.

Část 2. Studie in vitro na modelech odvozených od pacientů: Ve vybraných případech vygenerujeme indukované pluripotentní kmenové buňky a nervové progenitorové buňky (NES buňky), které poskytnou příležitost přímo studovat účinky časné neurogeneze v buňkách z pacienta a porovnat s buňkami získanými z normálních kontrol. Máme zájem studovat jak ranou neurogenezi ve 2D kultuře pomocí buněk NES, tak generovat další vývojově relevantní model, mozkové organoidy (minimozky), ve 3D kultuře přímo z buněčných linií iPS. Organoidní 3D kultura rekapituluje vývoj různých oblastí mozku a je proto jedinečným nástrojem pro vyšetřování mozkových poruch. Kromě toho by 3D neurální kultura mohla zlepšit buněčnou zralost a stimulovat expresi fenotypů onemocnění, které usnadňují lepší pochopení mechanismů onemocnění.

Část 3. Studie in vivo na modelu zebřičky: Zebřička (Danio rerio) je dobře fungující systém in vivo pro studium normálního a abnormálního embryologického vývoje. Duplikace jsou simulovány nadměrnou expresí a delecí RNA prostřednictvím CRISPR/Cas9 indukovaného narušení genu nebo morfolino knock-down. Hodnocení fenotypů je navrženo v souladu s fenotypy pozorovanými u pacientů (např. velikost hlavy, kraniofaciální defekty, kardiovaskulární malformace, defekty řasinek).

Cíl 3) Jak ovlivňují strukturální genomové varianty genovou expresi?

Plánujeme studovat efekty dlouhého dosahu třemi způsoby. Část 1. Abychom zhodnotili klinický dopad narušení TAD, budeme hledat takové události v datech CNV z databáze Clinical Genetics array (údaje od více než 6200 dětí se vzácnými NDD), LocusDB SV (volání SV od > 1000 pacientů se vzácnými onemocněními analyzovaných WGS v Clinical Genomics SciLifeLab) a veřejně dostupných databází (DECIPHER, ICCG a SWEGEN). Bioinformatická analýza bude kombinovat informace o fenotypovém překrývání mezi geny známého onemocnění obklopujícími SV a charakteristikami pacientů, stejně jako o fyzickém překrývání s tkáňově specifickými zesilovači a oblastmi TAD. Budou navrženy nové výpočetní přístupy pro objevování genů narušených podobnými mechanismy. Následné studie budou zahrnovat další charakterizaci pacienta a přizpůsobené studie RNA.

Část 2. Transkriptomová analýza vzorků pacientů se provádí pomocí RNA-seq. Protože ne každý gen je transkripčně aktivní v každé buňce, klíčem k úspěšnému dosažení tohoto cíle je přístup k biologicky relevantním vzorkům. Biopsie často nejsou dostupné, proto jsou v těchto případech iPS buňky alternativním způsobem, jak studovat biologicky relevantní účinky na expresi RNA. V případech se spárovanými daty WGS a RNA-seq budeme integrovat změny v úrovních transkripce a ASE jako výstup pro účinek SV na sousední geny.

Část 3. Buněčné a zvířecí studie: Zavedení specifických SV s CRISPR/Cas9 do lidských buněčných linií bude provedeno, když primární buňky nejsou dostupné, a linie zebrafish vytvořené v rámci cíle 2 mohou být také použity k vyhodnocení globálních účinků SV na úrovni organismu .