Strukturella kromosomförändringar och hjärnstörningar

PROJEKTBESKRIVNING Syfte 1) Vilka är de molekylära mekanismerna för bildning av strukturella genomiska varianter?

Vi har redan WGS-data från mer än 500 enskilda SV:er. För att förstå underliggande mutations- och sjukdomsmekanismer kommer vi att kombinera strukturell variantdetektion med positionsinformation för omarrangemanget. Detta kommer att vara särskilt viktigt för dupliceringar (platsen för det duplicerade genomiska segmentet är nyckeln till en korrekt klinisk tolkning) och för komplexa omarrangemang. För det andra kommer den exakta brytpunkten att fastställas och brytpunktsövergångar analyseras för sekvensmotiv.

Syfte 2) Vilka är de molekylära mekanismerna involverade i sjukdomspatologi?

Först kommer vi att använda WGS för att identifiera och karakterisera strukturella varianter. Därefter, för att förstå hur kandidatsjukdomsgenen eller -generna som påverkas av SVs orsakar kliniska symtom, kommer vi att studera de cellulära mekanismerna som är involverade i sjukdomspatologi på tre sätt:

Del 1. In vitro studier av primära celler: Effekter på uttryck och splitsning kommer att utvärderas i patientceller (fibroblaster eller B-cellinjer) med RT-PCR, qPCR och Western blot.

Del 2. In vitro-studier i patienthärledda modeller: I utvalda fall kommer vi att generera inducerade-pluripotenta stamceller och neurala progenitorceller (NES-celler), vilket kommer att ge en möjlighet att direkt studera effekterna av tidig neurogenes i celler från patient och jämför med celler som härrör från normala kontroller. Vi är intresserade av att studera både tidig neurogenes i 2D-odling med hjälp av NES-celler, såväl som att generera en annan utvecklingsrelevant modell, hjärnorganoider (minihjärnor), i 3D-odling direkt från iPS-cellinjer. Organoid 3D-kultur rekapitulerar utvecklingen av olika hjärnregioner och är därför ett unikt verktyg för att undersöka hjärnsjukdomar. Dessutom kan 3D-neuralkulturen förbättra cellmognad och stimulera uttryck av sjukdomsfenotyper som underlättar bättre förståelse av sjukdomsmekanismerna.

Del 3. In vivo-studier i en zebrafiskmodell: Zebrafisk (Danio rerio) är ett välfungerande in vivo-system för studier av normal och onormal embryologisk utveckling. Duplikationer simuleras genom RNA-överuttryck och deletion genom CRISPR/Cas9-inducerad genstörning eller morpholino-knock-down. Bedömningen av fenotyperna är utformad i enlighet med de som observerats hos patienter (t.ex. huvudstorlek, kraniofaciala defekter, kardiovaskulära missbildningar, ciliadefekter).

Syfte 3) Hur påverkar strukturella genomiska varianter genuttryck?

Vi planerar att studera långdistanseffekter på tre sätt. Del 1. För att bedöma den kliniska effekten av TAD-störningar kommer vi att söka efter sådana händelser i CNV-data från Clinical Genetics array-databasen (data från över 6200 barn med sällsynta NDD), LocusDB SV (SV-samtal från >1000 patienter med sällsynta sjukdomar analyserade av WGS vid Clinical Genomics SciLifeLab) och allmänt tillgängliga databaser (DECIPHER, ICCG och SWEGEN). Den bioinformatiska analysen kommer att kombinera information om fenotypisk överlappning mellan kända sjukdomsgener som omger SV och patienternas egenskaper, såväl som om fysisk överlappning med vävnadsspecifika förstärkare och TAD-regioner. Nya beräkningsmetoder kommer att utformas för upptäckten av gener som störs av liknande mekanismer. Uppföljningsstudier kommer att involvera ytterligare patientkarakterisering och skräddarsydda RNA-studier.

Del 2. Transkriptomanalys av patientprover görs med RNA-seq. Eftersom inte varje gen är transkriptionellt aktiv i varje cell, är en nyckel för att framgångsrikt uppnå detta mål tillgång till biologiskt relevanta prover. Ofta är biopsier inte tillgängliga, därför är iPS-celler i dessa fall ett alternativt sätt att studera biologiskt relevanta effekter på RNA-uttryck. I fall med parade WGS- och RNA-seq-data kommer vi att integrera förändringar i transkriptionsnivåer och ASE som en avläsning för SVs-effekten på närliggande gener.

Del 3. Cell- och djurstudier: Införande av specifika SVs med CRISPR/Cas9 i mänskliga cellinjer kommer att göras när de primära cellerna är otillgängliga och zebrafisklinjer skapade under mål 2 kan också användas för att utvärdera globala effekter av SVs på organismnivå .