Structurele chromosomenherschikkingen en hersenstoornissen

PROJECTBESCHRIJVING Doel 1) Wat zijn de moleculaire vormingsmechanismen voor structurele genomische varianten?

We beschikken al over WGS-gegevens van meer dan 500 individuele SV's. Om de onderliggende mutatie- en ziektemechanismen te begrijpen, zullen we structurele variantdetectie combineren met positionele informatie voor de herschikking. Dit zal vooral belangrijk zijn voor duplicaties (de locatie van het gedupliceerde genomische segment is de sleutel tot een correcte klinische interpretatie) en voor complexe herschikkingen. Ten tweede zal het exacte breekpunt worden vastgesteld en zullen breekpuntovergangen worden geanalyseerd op sequentiemotieven.

Doel 2) Wat zijn de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij ziektepathologie?

Eerst zullen we WGS gebruiken om structurele varianten te identificeren en te karakteriseren. Om vervolgens te begrijpen hoe de kandidaat-ziektegenen die door de SV's worden beïnvloed, klinische symptomen veroorzaken, zullen we de cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de ziektepathologie op drie manieren bestuderen:

Deel 1. In vitro studies van primaire cellen: Effecten op expressie en splitsing zullen worden geëvalueerd in patiëntencellen (fibroblasten of B-cellijnen) met RT-PCR, qPCR en Western blot.

Deel 2. In vitro studies in patiënt-afgeleide modellen: In geselecteerde gevallen zullen we geïnduceerde pluripotente stamcellen en neurale voorlopercellen (NES-cellen) genereren, wat een mogelijkheid zal bieden om de effecten van vroege neurogenese in cellen uit de patiënt en vergelijk deze met cellen afkomstig van normale controles. We zijn geïnteresseerd in het bestuderen van zowel de vroege neurogenese in 2D-cultuur met behulp van de NES-cellen, als in het genereren van een ander ontwikkelingsrelevant model, hersenorganoïden (mini-hersenen), in 3D-cultuur rechtstreeks uit iPS-cellijnen. De organoïde 3D-cultuur recapituleert de ontwikkeling van verschillende hersengebieden en is daarom een ​​uniek hulpmiddel om hersenaandoeningen te onderzoeken. Bovendien zou de 3D-neurale cultuur de celrijpheid kunnen verbeteren en de expressie van ziektefenotypes kunnen stimuleren die een beter begrip van de ziektemechanismen mogelijk maken.

Deel 3. In vivo studies in een zebravismodel: De zebravis (Danio rerio) is een goed functionerend in vivo systeem voor onderzoek naar normale en abnormale embryologische ontwikkeling. Duplicaties worden gesimuleerd door overexpressie en verwijdering van RNA via CRISPR/Cas9-geïnduceerde genverstoring of morfolino-knock-down. De beoordeling van de fenotypes is ontworpen in overeenstemming met de fenotypen die bij patiënten zijn waargenomen (bijv. hoofdomvang, craniofaciale defecten, cardiovasculaire misvormingen, cilia-defecten).

Doel 3) Hoe beïnvloeden structurele genomische varianten de genexpressie?

We zijn van plan langetermijneffecten op drie manieren te bestuderen. Deel 1. Om de klinische impact van TAD-verstoringen te beoordelen, zullen we naar dergelijke gebeurtenissen zoeken in de CNV-gegevens van de Clinical Genetics array-database (gegevens van meer dan 6200 kinderen met zeldzame NDD's), LocusDB SV (SV-oproepen van> 1000 patiënten met zeldzame ziekten geanalyseerd door WGS bij Clinical Genomics SciLifeLab) en publiekelijk beschikbare databases (DECIPHER, ICCG en SWEGEN). De bio-informatica-analyse zal informatie combineren over fenotypische overlap tussen bekende ziektegenen rond de SV en de kenmerken van de patiënt, evenals over fysieke overlap met weefselspecifieke versterkers en TAD-regio's. Er zullen nieuwe computationele benaderingen worden ontworpen voor de ontdekking van genen die door vergelijkbare mechanismen worden verstoord. Vervolgstudies omvatten verdere karakterisering van de patiënt en op maat gemaakte RNA-studies.

Deel 2. Transcriptoomanalyse van patiëntmonsters wordt uitgevoerd met RNA-seq. Omdat niet elk gen transcriptioneel actief is in elke cel, is toegang tot biologisch relevante monsters de sleutel tot het succesvol bereiken van dit doel. Vaak zijn biopsieën niet beschikbaar. In die gevallen zijn iPS-cellen een alternatieve manier om biologisch relevante effecten op RNA-expressie te bestuderen. In gevallen met gepaarde WGS- en RNA-seq-gegevens zullen we veranderingen in transcriptieniveaus en ASE integreren als uitlezing voor het SV-effect op naburige genen.

Deel 3. Cel- en dierstudies: Introductie van specifieke SV's met CRISPR/Cas9 in menselijke cellijnen zal worden uitgevoerd wanneer de primaire cellen niet beschikbaar zijn en zebravislijnen die onder doel 2 zijn gecreëerd, kunnen ook worden gebruikt om de globale effecten van SV's op organismeniveau te evalueren .