Strukturelle Chromosomenumlagerungen und Gehirnstörungen

PROJEKTBESCHREIBUNG Ziel 1) Was sind die molekularen Mechanismen der Bildung struktureller genomischer Varianten?

Wir verfügen bereits über WGS-Daten von mehr als 500 einzelnen SVs. Um die zugrunde liegenden Mutations- und Krankheitsmechanismen zu verstehen, werden wir die Erkennung struktureller Varianten mit Positionsinformationen für die Neuordnung kombinieren. Dies ist besonders wichtig für Duplikationen (die Lage des duplizierten Genomsegments ist der Schlüssel für eine korrekte klinische Interpretation) und für komplexe Neuanordnungen. Zweitens wird der genaue Haltepunkt ermittelt und die Haltepunktverbindungen auf Sequenzmotive hin analysiert.

Ziel 2) Welche molekularen Mechanismen sind an der Krankheitspathologie beteiligt?

Zunächst werden wir WGS verwenden, um Strukturvarianten zu identifizieren und zu charakterisieren. Um zu verstehen, wie die von den SVs betroffenen Kandidatengene für die Krankheit klinische Symptome verursachen, werden wir als Nächstes die zellulären Mechanismen untersuchen, die an der Pathologie der Krankheit beteiligt sind, und zwar auf drei Arten:

Teil 1. In-vitro-Studien an Primärzellen: Die Auswirkungen auf Expression und Spleißen werden in Patientenzellen (Fibroblasten oder B-Zelllinien) mit RT-PCR, qPCR und Western Blot untersucht.

Teil 2. In-vitro-Studien in von Patienten abgeleiteten Modellen: In ausgewählten Fällen werden wir induziert-pluripotente Stammzellen und neurale Vorläuferzellen (NES-Zellen) erzeugen, die die Möglichkeit bieten, die Auswirkungen der frühen Neurogenese in Zellen aus dem Patienten direkt zu untersuchen Patienten untersuchen und mit Zellen vergleichen, die von normalen Kontrollen stammen. Wir sind daran interessiert, sowohl die frühe Neurogenese in 2D-Kultur unter Verwendung der NES-Zellen zu untersuchen als auch ein weiteres entwicklungsrelevantes Modell, Gehirnorganoide (Minigehirne), in 3D-Kultur direkt aus iPS-Zelllinien zu generieren. Die organoide 3D-Kultur rekapituliert die Entwicklung verschiedener Hirnregionen und ist daher ein einzigartiges Werkzeug zur Untersuchung von Hirnstörungen. Darüber hinaus könnte die 3D-Neuralkultur die Zellreife verbessern und die Expression von Krankheitsphänotypen stimulieren, was ein besseres Verständnis der Krankheitsmechanismen ermöglicht.

Teil 3. In-vivo-Studien in einem Zebrafischmodell: Zebrafisch (Danio rerio) ist ein gut funktionierendes In-vivo-System für Studien zur normalen und abnormalen embryonalen Entwicklung. Duplikationen werden durch RNA-Überexpression und -Deletion durch CRISPR/Cas9-induzierte Genunterbrechung oder Morpholino-Knockdown simuliert. Die Beurteilung der Phänotypen richtet sich nach den bei Patienten beobachteten Merkmalen (z. B. Kopfgröße, kraniofaziale Defekte, kardiovaskuläre Fehlbildungen, Ziliendefekte).

Ziel 3) Wie wirken sich strukturelle genomische Varianten auf die Genexpression aus?

Wir planen, Fernwirkungen auf drei Arten zu untersuchen. Teil 1. Um die klinischen Auswirkungen von TAD-Störungen zu bewerten, werden wir nach solchen Ereignissen in den CNV-Daten aus der Array-Datenbank Clinical Genetics (Daten von über 6200 Kindern mit seltenen NDDs) und LocusDB SV (SV-Anrufe von >1000 Patienten mit seltenen Krankheiten, analysiert von WGS) suchen bei Clinical Genomics SciLifeLab) und öffentlich zugänglichen Datenbanken (DECIPHER, ICCG und SWEGEN). Die bioinformatische Analyse wird Informationen zur phänotypischen Überlappung zwischen bekannten Krankheitsgenen rund um den SV und den Merkmalen der Patienten sowie zur physischen Überlappung mit gewebespezifischen Enhancern und TAD-Regionen kombinieren. Für die Entdeckung von Genen, die durch ähnliche Mechanismen gestört werden, werden neuartige rechnerische Ansätze entwickelt. Folgestudien umfassen eine weitere Patientencharakterisierung und maßgeschneiderte RNA-Studien.

Teil 2. Die Transkriptomanalyse von Patientenproben erfolgt durch RNA-seq. Da nicht jedes Gen in jeder Zelle transkriptionell aktiv ist, ist der Zugang zu biologisch relevanten Proben ein Schlüssel zum erfolgreichen Erreichen dieses Ziels. Da Biopsien oft nicht verfügbar sind, sind iPS-Zellen in diesen Fällen eine alternative Möglichkeit, biologisch relevante Auswirkungen auf die RNA-Expression zu untersuchen. In Fällen mit gepaarten WGS- und RNA-seq-Daten werden wir Änderungen in den Transkriptionsniveaus und ASE als Anzeige für den SVs-Effekt auf benachbarte Gene integrieren.

Teil 3. Zell- und Tierstudien: Die Einführung spezifischer SVs mit CRISPR/Cas9 in menschlichen Zelllinien erfolgt, wenn die Primärzellen nicht verfügbar sind, und unter Ziel 2 erstellte Zebrafischlinien können auch zur Bewertung der globalen Auswirkungen von SVs auf Organismusebene verwendet werden .