Rearranjos estruturais de cromossomos e distúrbios cerebrais

DESCRIÇÃO DO PROJETO Objetivo 1) Quais são os mecanismos moleculares de formação de variantes genômicas estruturais?

Já temos dados WGS de mais de 500 SVs individuais. Para compreender os mecanismos mutacionais e de doença subjacentes, combinaremos a detecção de variantes estruturais com informações posicionais para o rearranjo. Isto será particularmente importante para duplicações (a localização do segmento genómico duplicado é fundamental para uma interpretação clínica correta) e para rearranjos complexos. Em segundo lugar, o ponto de interrupção exato será estabelecido e as junções do ponto de interrupção analisadas para motivos de sequência.

Objetivo 2) Quais são os mecanismos moleculares envolvidos na patologia da doença?

Primeiro usaremos o WGS para identificar e caracterizar variantes estruturais. A seguir, para entender como o(s) gene(s) candidato(s) da doença afetado(s) pelas VSs causam sintomas clínicos, estudaremos os mecanismos celulares envolvidos na patologia da doença de três maneiras:

Parte 1. Estudos in vitro de células primárias: Os efeitos na expressão e splicing serão avaliados em células de pacientes (fibroblastos ou linhagens de células B) com RT-PCR, qPCR e Western blot.

Parte 2. Estudos in vitro em modelos derivados de pacientes: Em casos selecionados, geraremos células-tronco pluripotentes induzidas e células progenitoras neurais (células NES), que proporcionarão uma oportunidade de estudar diretamente os efeitos da neurogênese precoce em células do paciente e compare com células derivadas de controles normais. Estamos interessados ​​em estudar tanto a neurogênese inicial em cultura 2D usando células NES, quanto em gerar outro modelo relevante para o desenvolvimento, organoides cerebrais (minicérebros), em cultura 3D diretamente de linhagens de células iPS. A cultura organoide 3D recapitula o desenvolvimento de várias regiões do cérebro e é, portanto, uma ferramenta única para investigar distúrbios cerebrais. Além disso, a cultura neural 3D poderia melhorar a maturidade celular e estimular a expressão de fenótipos de doenças que facilitam uma melhor compreensão dos mecanismos da doença.

Parte 3. Estudos in vivo em um modelo de peixe-zebra: O peixe-zebra (Danio rerio) é um sistema in vivo que funciona bem para estudos de desenvolvimento embriológico normal e anormal. As duplicações são simuladas pela superexpressão e exclusão do RNA através da interrupção do gene induzida por CRISPR/Cas9 ou da derrubada do morfolino. A avaliação dos fenótipos é projetada de acordo com aqueles observados nos pacientes (por exemplo, tamanho da cabeça, defeitos craniofaciais, malformações cardiovasculares, defeitos ciliares).

Objetivo 3) Como as variantes genômicas estruturais impactam a expressão gênica?

Planejamos estudar os efeitos de longo alcance de três maneiras. Parte 1. Para avaliar o impacto clínico das interrupções do TAD, procuraremos tais eventos nos dados CNV do banco de dados da matriz Clinical Genetics (dados de mais de 6.200 crianças com NDDs raros), LocusDB SV (chamadas de SV de >1.000 pacientes com doenças raras analisadas pelo WGS no Clinical Genomics SciLifeLab) e bancos de dados disponíveis publicamente (DECIPHER, ICCG e SWEGEN). A análise bioinformática combinará informações sobre a sobreposição fenotípica entre genes de doenças conhecidas que cercam o VS e as características dos pacientes, bem como sobre a sobreposição física com intensificadores específicos de tecidos e regiões TAD. Novas abordagens computacionais serão projetadas para a descoberta de genes perturbados por mecanismos semelhantes. Os estudos de acompanhamento envolverão caracterização adicional do paciente e estudos personalizados de RNA.

Parte 2. A análise do transcriptoma de amostras de pacientes é feita por RNA-seq. Uma vez que nem todos os genes são transcricionalmente activos em todas as células, uma chave para alcançar este objectivo com sucesso é o acesso a amostras biologicamente relevantes. Muitas vezes as biópsias não estão disponíveis, portanto, nesses casos, as células iPS são uma forma alternativa de estudar efeitos biologicamente relevantes na expressão do RNA. Nos casos com dados WGS e RNA-seq pareados, integraremos alterações nos níveis de transcrição e ASE como uma leitura do efeito dos SVs nos genes vizinhos.

Parte 3. Estudos celulares e animais: A introdução de SVs específicos com CRISPR/Cas9 em linhas celulares humanas será feita quando as células primárias não estiverem disponíveis e as linhas de peixe-zebra criadas no âmbito do objectivo 2 também poderão ser utilizadas para avaliar os efeitos globais dos SVs ao nível do organismo .