Strukturelle kromosomomorganiseringer og hjernesykdommer

PROSJEKTBESKRIVELSE Mål 1) Hva er de molekylære mekanismene for dannelse for strukturelle genomiske varianter?

Vi har allerede WGS-data fra mer enn 500 individuelle SV-er. For å forstå underliggende mutasjons- og sykdomsmekanismer, vil vi kombinere strukturell variantdeteksjon med posisjonsinformasjon for omorganiseringen. Dette vil være spesielt viktig for dupliseringer (plasseringen av det dupliserte genomiske segmentet er nøkkelen til en korrekt klinisk tolkning) og for komplekse omorganiseringer. For det andre vil det eksakte bruddpunktet etableres og bruddpunktskryssene analyseres for sekvensmotiver.

Mål 2) Hva er de molekylære mekanismene involvert i sykdomspatologi?

Først skal vi bruke WGS til å identifisere og karakterisere strukturelle varianter. Deretter, for å forstå hvordan kandidatsykdomsgenene som påvirkes av SV-ene forårsaker kliniske symptomer, vil vi studere de cellulære mekanismene involvert i sykdomspatologi på tre måter:

Del 1. In vitro studier av primære celler: Effekter på ekspresjon og spleising, vil bli evaluert i pasientceller (fibroblaster eller B-cellelinjer) med RT-PCR, qPCR og Western blot.

Del 2. In vitro-studier i pasientavledede modeller: I utvalgte tilfeller vil vi generere induserte-pluripotente stamceller og nevrale stamceller (NES-celler), som vil gi en mulighet til direkte å studere effektene av tidlig nevrogenese i celler fra pasient og sammenligne med celler avledet fra normale kontroller. Vi er interessert i å studere både tidlig nevrogenese i 2D-kultur ved bruk av NES-cellene, samt å generere en annen utviklingsrelevant modell, hjerneorganoider (minihjerner), i 3D-kultur direkte fra iPS-cellelinjer. Organoid 3D-kultur rekapitulerer utviklingen av ulike hjerneregioner og er derfor et unikt verktøy for å undersøke hjernesykdommer. Videre kan 3D-nevrale kulturen forbedre cellemodenhet og stimulere uttrykk for sykdomsfenotyper som letter bedre forståelse av sykdomsmekanismene.

Del 3. In vivo studier i en sebrafiskmodell: Sebrafisk (Danio rerio) er et velfungerende in vivo system for studier av normal og unormal embryologisk utvikling. Duplikasjoner simuleres ved RNA-overekspresjon og -sletting gjennom CRISPR/Cas9-indusert genforstyrrelse eller morpholino-knock-down. Vurdering av fenotypene er utformet i samsvar med de som er observert hos pasienter (f.eks. hodestørrelse, kraniofaciale defekter, kardiovaskulære misdannelser, flimmerhårdefekter).

Mål 3) Hvordan påvirker strukturelle genomiske varianter genuttrykk?

Vi planlegger å studere langdistanseeffekter på tre måter. Del 1. For å vurdere den kliniske effekten av TAD-forstyrrelser vil vi søke etter slike hendelser i CNV-dataene fra Clinical Genetics array-databasen (data fra over 6200 barn med sjeldne NDD), LocusDB SV (SV-anrop fra >1000 pasienter med sjeldne sykdommer analysert av WGS ved Clinical Genomics SciLifeLab) og offentlig tilgjengelige databaser (DECIPHER, ICCG og SWEGEN). Den bioinformatiske analysen vil kombinere informasjon om fenotypisk overlapp mellom kjente sykdomsgener rundt SV og pasientenes egenskaper, samt om fysisk overlapping med vevsspesifikke forsterkere og TAD-regioner. Nye beregningsmessige tilnærminger vil bli designet for oppdagelsen av gener forstyrret av lignende mekanismer. Oppfølgingsstudier vil involvere ytterligere pasientkarakterisering og tilpassede RNA-studier.

Del 2. Transkriptomanalyse av pasientprøver gjøres ved RNA-seq. Siden ikke hvert gen er transkripsjonelt aktivt i hver celle, er en nøkkel for å oppnå dette målet tilgang til biologisk relevante prøver. Ofte er biopsier ikke tilgjengelige, derfor er iPS-celler i disse tilfellene en alternativ måte å studere biologisk relevante effekter på RNA-ekspresjon. I tilfeller med sammenkoblede WGS- og RNA-seq-data, vil vi integrere endringer i transkripsjonsnivåer og ASE som en avlesning for SVs-effekten på nabogener.

Del 3. Celle- og dyrestudier: Introduksjon av spesifikke SV-er med CRISPR/Cas9 i humane cellelinjer vil bli gjort når primærcellene er utilgjengelige og sebrafisklinjer opprettet under mål 2 kan også brukes til å evaluere globale effekter av SV-er på organismenivå .