Strukturalne rearanżacje chromosomów i zaburzenia mózgu

OPIS PROJEKTU Cel 1) Jakie są molekularne mechanizmy powstawania strukturalnych wariantów genomowych?

Mamy już dane WGS z ponad 500 indywidualnych SV. Aby zrozumieć podstawowe mechanizmy mutacji i chorób, połączymy wykrywanie wariantów strukturalnych z informacjami o położeniu na potrzeby przegrupowania. Będzie to szczególnie ważne w przypadku duplikacji (lokalizacja zduplikowanego segmentu genomu jest kluczem do prawidłowej interpretacji klinicznej) i złożonych rearanżacji. Po drugie, zostanie ustalony dokładny punkt przerwania i przeanalizowane zostaną połączenia punktów przerwania pod kątem motywów sekwencji.

Cel 2) Jakie są mechanizmy molekularne związane z patologią choroby?

Najpierw użyjemy WGS do identyfikacji i scharakteryzowania wariantów konstrukcyjnych. Następnie, aby zrozumieć, w jaki sposób geny potencjalnej choroby, na które wpływają SV, powodują objawy kliniczne, przeanalizujemy mechanizmy komórkowe zaangażowane w patologię choroby na trzy sposoby:

Część 1. Badania in vitro komórek pierwotnych: wpływ na ekspresję i splicing zostanie oceniony na komórkach pacjenta (fibroblastach lub liniach komórek B) za pomocą RT-PCR, qPCR i Western blot.

Część 2. Badania in vitro w modelach pochodzących od pacjentów: W wybranych przypadkach wygenerujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste i neuronalne komórki progenitorowe (komórki NES), co umożliwi bezpośrednie badanie skutków wczesnej neurogenezy w komórkach pochodzących z pacjenta i porównać z komórkami pochodzącymi z normalnej kontroli. Jesteśmy zainteresowani zarówno badaniem wczesnej neurogenezy w hodowli 2D z wykorzystaniem komórek NES, jak i generowaniem innego istotnego rozwojowo modelu, organoidów mózgowych (mini mózgów), w hodowli 3D bezpośrednio z linii komórkowych iPS. Kultura organoidów 3D podsumowuje rozwój różnych obszarów mózgu i dlatego jest unikalnym narzędziem do badania zaburzeń mózgu. Co więcej, trójwymiarowa kultura neuronowa mogłaby poprawić dojrzałość komórek i stymulować ekspresję fenotypów chorób, co ułatwi lepsze zrozumienie mechanizmów choroby.

Część 3. Badania in vivo na modelu danio pręgowanego: Danio pręgowany (Danio rerio) to dobrze funkcjonujący system in vivo do badań prawidłowego i nieprawidłowego rozwoju embriologicznego. Duplikacje symuluje się poprzez nadekspresję i delecję RNA w wyniku indukowanego CRISPR/Cas9 przerwania genu lub obniżenia poziomu morfoliny. Ocenę fenotypów projektuje się na podstawie fenotypów obserwowanych u pacjentów (np. wielkość głowy, wady twarzoczaszki, wady układu sercowo-naczyniowego, wady rzęsek).

Cel 3) Jak strukturalne warianty genomowe wpływają na ekspresję genów?

Planujemy badać efekty dalekosiężne na trzy sposoby. Część 1. Aby ocenić wpływ kliniczny zakłóceń TAD, będziemy szukać takich zdarzeń w danych CNV z bazy danych Clinical Genetics (dane od ponad 6200 dzieci z rzadkimi NDD), LocusDB SV (wezwania SV od >1000 pacjentów z rzadkimi chorobami analizowanymi przez WGS w Clinical Genomics SciLifeLab) i publicznie dostępnych bazach danych (DECIPHER, ICCG i SWEGEN). Analiza bioinformatyczna połączy informacje na temat fenotypowego nakładania się genów znanych chorób otaczających SV i cech pacjentów, a także fizycznego nakładania się ze specyficznymi tkankowo wzmacniaczami i regionami TAD. Opracowane zostaną nowatorskie podejścia obliczeniowe do odkrywania genów zakłócanych przez podobne mechanizmy. Dalsze badania będą obejmować dalszą charakterystykę pacjentów i dostosowane do indywidualnych potrzeb badania RNA.

Część 2. Analizę transkryptomu próbek pacjentów przeprowadza się metodą RNA-seq. Ponieważ nie każdy gen jest aktywny transkrypcyjnie w każdej komórce, kluczem do pomyślnego osiągnięcia tego celu jest dostęp do biologicznie istotnych próbek. Często biopsje nie są dostępne, dlatego w takich przypadkach komórki iPS stanowią alternatywną metodę badania biologicznie istotnego wpływu na ekspresję RNA. W przypadkach ze sparowanymi danymi WGS i seq RNA zintegrujemy zmiany w poziomach transkrypcji i ASE jako odczyt wpływu SV na sąsiednie geny.

Część 3. Badania na komórkach i na zwierzętach: Wprowadzenie specyficznych SV z CRISPR/Cas9 do ludzkich linii komórkowych zostanie przeprowadzone, gdy komórki pierwotne będą niedostępne, a linie danio pręgowanego utworzone w ramach celu 2 można również wykorzystać do oceny globalnego wpływu SV na poziom organizmu .