褪黑素在小儿手术中的镇痛和抗氧化作用

褪黑激素在保护接受手术的新生儿免受氧化应激 (OS) 的有害影响方面具有潜在作用。 据报道，给予外源性褪黑激素后，新生儿术后期间的脂质和蛋白质过氧化显着减少。 最近，宋等人。据报道，sirtuin 1 (SIRT1) 在疼痛的发病机制中也发挥着关键作用，在慢性疼痛（如神经性疼痛和炎性疼痛）中显示出镇痛作用。 在这项前瞻性、随机、双盲试点研究中，我们测试了这样的假设：褪黑激素可减少接受手术的儿童的 OS 和涉及 Sirtuin 通路的术后疼痛。

口服褪黑素（Dicoson，Dicofarm，意大利，5 滴 = 1 mg）。 该产品已列入卫生部网站（http://www.ministerosalut.it/alimenti/dietetica）的膳食补充剂登记册中 并分类为以下代码：943314283。 该产品符合 DL n 的欧洲食品指令。 2004 年 5 月 21 日第 169 号法令，而不是欧洲药品指令 2001/20/EC 在意大利层面上转换为 D.L.名词2003 年 6 月 24 日第 211 号法令。 褪黑激素给药具有良好的安全性，没有已知的副作用。

根据制造商的说明，使用 Antibodies.com (A87093) 的竞争性酶联免疫吸附测定 (cELISA) 试剂盒在每个实验时间点（T0、T1、T2）评估褪黑激素血浆水平。 来自 Mel 治疗儿童的 T1 和 T2 血浆样本疑似浓度高于最高标准 (500 pg/mL)，在分析前用样本稀释剂按 1:100 (v/v) 稀释。 在 Thermo Scientific (MultiSkan FC) 酶标仪中在 450 nm 处监测显色，并使用四参数逻辑 (4-PL) 曲线拟合生成标准曲线（范围 7.813-500 pg/mL）。 测定的灵敏度为 4.688 pg/mL；测定内和测定间变异系数分别<8% 和<10%。

使用 Antibodies.com (A86962) 的 cELISA 试剂盒测量作为脂质过氧化标志物的 4-羟基壬烯醛 (4-HNE)，以评估 OS。 通过读取 450 nm 处的吸光度并参考标准曲线（范围 31.25-2000 皮克/毫升）。 测定的灵敏度为 18.75 pg/mL；测定内和测定间变异系数分别<8% 和<10%。

使用 Invitrogen 的 ELISA 试剂盒 (EH427RB) 对 SIRT1 进行定量。 分析前按照制造商的指示将血浆样品按 1:2 稀释。 SIRT1 浓度通过 450 nm 处的吸光度读数并参考标准曲线（范围 1.23-300 ng/mL）计算。 测定的灵敏度为1.23 ng/mL；测定内和测定间变异系数分别<10% 和<12%。

我们根据可用的定性定量血浆样本进行了 microRNA 分析（每个时间点 T0、T1 和 T2 的 N=3）。 使用 Norgen 总 RNA 分离试剂盒从血浆中分离 MicroRNA（miR-34 和 miR-124a）13。使用 TaqMan miRNA 测定评估血浆 microRNA 和掺入 cel-miR-39 的表达。 TaqMan miRNA 逆转录试剂盒用于逆转录 miRNA。 随后，在 20 μL PCR 混合物中进行 RT-qPCR，其中包含 1 μL 20× TaqMan miRNA 检测，其中含有 PCR 引物和探针 (5'-FAM)、10 μL 2×TaqMan Universal PCR Master Mix No Amp Erase UNG和 5 μL 反转录产物。 反应首先在 95°C 孵育 10 分钟，然后在 95°C 15 秒和 60°C 1 分钟进行 40 个循环。 实时定量 PCR (RT-qPCR) 在 ABIPRISM 7500 实时 PCR 系统上进行。 通过 7500 系统软件 (1 1.4.0) 分析数据，并设置自动比较阈值 (Ct) 以适应基线。 检测阈值设置为 35 Ct。 采用Ct法计算miR-34和miR-124a的相对量：ΔCt=Ct(miR-34/miR-124a)-Ct(参考miRNA)； 2-ΔCt。