Smärtstillande och antioxidanteffekter av melatonin vid pediatrisk kirurgi

Melatonin visar en potentiell roll för att skydda nyfödda som genomgår operation från de skadliga effekterna av oxidativ stress (OS). Efter administrering av exogent melatonin har en signifikant minskning av lipid- och proteinperoxidation under den postoperativa perioden rapporterats hos nyfödda. Nyligen har Song et al. rapporterade att sirtuin 1 (SIRT1) också spelar en avgörande roll i patogenesen av smärta, och visar smärtstillande effekter vid kroniska smärttillstånd som neuropatisk och inflammatorisk smärta. I denna prospektiva, randomiserade, dubbelblinda pilotstudie testar vi hypotesen att melatonin minskar OS och postoperativ smärta som involverar sirtuin-vägen hos barn som genomgår operation.

Melatonin (Dicoson, Dicofarm, Italien, 5 droppar = 1 mg) administrerades oralt. Produkten är listad i registret över kosttillskott på hälsoministeriets webbplats (http://www.ministerosalute.it/alimenti/dietetica) och är klassificerad med följande kod: 943314283. Denna produkt omfattas av det europeiska direktivet om livsmedel enligt DL n. 169 av den 21 maj 2004, och inte till det europeiska läkemedelsdirektivet 2001/20/EG införlivat på italiensk nivå med D.L. n. 211 av den 24 juni 2003. Administrering av melatonin har en bra säkerhetsprofil, utan kända biverkningar.

Melatoninplasmanivåer utvärderades vid varje experimentell tidpunkt (TO, T1, T2) med användning av en kompetitiv enzymkopplad immunosorbentanalys (cELISA) från Antibodies.com (A87093) enligt tillverkarens instruktioner. T1- och T2-plasmaprover från Mel-behandlade barn som misstänks innehålla koncentrationer högre än den högsta standarden (500 pg/ml) späddes 1:100 (v/v) med provspädningsmedel före analys. Färgutvecklingen övervakades vid 450 nm i en Thermo Scientific (MultiSkan FC) mikroplattläsare, och en standardkurva (intervall 7,813-500 pg/ml) genererades med en fyra-parameter logistisk (4-PL) kurvanpassning. Känsligheten för analysen var 4,688 pg/ml; variationskoefficienterna inom och mellan analyser var <8 % respektive <10 %.

4-Hydroxynonenal (4-HNE) som markör för lipidperoxidation mättes för att utvärdera OS genom att använda ett cELISA-kit från Antibodies.com (A86962). Plasmakoncentrationer beräknades genom att läsa av absorbansen vid 450 nm och hänvisa till standardkurvan (intervall 31,25-2000) pg/ml). Känsligheten för analysen var 18,75 pg/ml; variationskoefficienterna inom och mellan analyser var <8 % respektive <10 %.

SIRT1 kvantifierades med användning av ett ELISA-kit från Invitrogen (EH427RB). Plasmaprover späddes 1:2 enligt anvisningar från tillverkaren före analys. SIRT1-koncentrationer beräknades genom absorbansavläsning vid 450 nm och med hänvisning till standardkurvan (intervall 1,23-300 ng/ml). Känsligheten för analysen var 1,23 ng/ml; variationskoefficienterna inom och mellan analyser var <10 % respektive <12 %.

Vi utförde mikroRNA-analyser baserade på det kvali-kvantitativa plasmaprovet tillgängligt (N=3 vid varje tidpunkt, T0, T1 och T2). MikroRNA (miR-34 och miR-124a) isolerades från plasma med hjälp av Norgen total RNA-isoleringskit13. Plasma-mikroRNA och spike-in cel-miR-39-uttryck utvärderades med TaqMan miRNA-analysen. TaqMan miRNA omvänd transkriptionskit användes för att omvända transkription av miRNA. Därefter utfördes RT-qPCR i 20 μL PCR-mix innehållande 1 μL 20x TaqMan miRNA-analys, som innehöll PCR-primers och prober (5'-FAM), 10 μL 2xTaqMan Universal PCR Master Mix No Amp Erase UNG och 5 μL omvänt transkriberad produkt. Reaktionen inkuberades först vid 95 °C i 10 minuter följt av 40 cykler vid 95 °C under 15 s och vid 60 °C under 1 min. Den kvantitativa realtids-PCR (RT-qPCR) utfördes på ett ABIPRISM 7500 Real Time PCR-system. Data analyserades av en 7500-systemmjukvara (1 1.4.0) med inställningen för automatiskt jämförande tröskelvärde (Ct) för anpassning av baslinjen. Detektionströskelvärden sattes till 35 Ct. De relativa mängderna av miR-34 och miR-124a beräknades med hjälp av Ct-metoden: ΔCt = Ct (miR-34/miR-124a) - Ct (referens miRNA); 2-ACt.