Analgetické a antioxidační účinky melatoninu v dětské chirurgii

Melatonin ukazuje potenciální roli při ochraně novorozenců podstupujících chirurgický zákrok před škodlivými účinky oxidačního stresu (OS). Po podání exogenního melatoninu bylo u novorozenců zaznamenáno významné snížení peroxidace lipidů a proteinů v pooperačním období. Nedávno Song a spol. uvedli, že sirtuin 1 (SIRT1) také hraje kritickou roli v patogenezi bolesti a vykazuje analgetické účinky u chronických bolestivých stavů, jako je neuropatická a zánětlivá bolest. V této prospektivní, randomizované, dvojitě zaslepené pilotní studii testujeme hypotézu, že melatonin snižuje OS a pooperační bolest zahrnující sirtuinovou dráhu u dětí podstupujících chirurgický zákrok.

Melatonin (Dicoson, Dicofarm, Itálie, 5 kapek = 1 mg) byl podáván perorálně. Přípravek je uveden v Registru doplňků stravy na stránkách Ministerstva zdravotnictví (http://www.ministerosalute.it/alimenti/dietetica) a je klasifikován s následujícím kódem: 943314283. Tento výrobek podléhá evropské směrnici o potravinách podle DL n. 169 ze dne 21. května 2004, a nikoli evropské směrnici o léčivech 2001/20/ES transponované na italské úrovni s D.L. n. 211 ze dne 24. června 2003. Podávání melatoninu má dobrý bezpečnostní profil bez známých nežádoucích účinků.

Hladiny melatoninu v plazmě byly hodnoceny v každém experimentálním časovém bodě (TO, T1, T2) za použití kompetitivní soupravy pro imunosorbentní test s enzymatickým spojením (cELISA) od Antibodies.com (A87093) podle pokynů výrobce. Vzorky plazmy T1 a T2 od dětí léčených Mel, u nichž bylo podezření, že obsahují koncentrace vyšší než nejvyšší standard (500 pg/ml), byly před analýzou zředěny v poměru 1:100 (v/v) ředidlem vzorků. Vývoj barvy byl monitorován při 450 nm ve čtečce mikrodestiček Thermo Scientific (MultiSkan FC) a standardní křivka (rozsah 7,813-500 pg/ml) byla vytvořena pomocí čtyřparametrové logistické (4-PL) křivky. Citlivost testu byla 4,688 pg/ml; variační koeficienty uvnitř a mezi testy byly <8 % a <10 %, v daném pořadí.

4-Hydroxynonenal (4-HNE) jako marker peroxidace lipidů byl měřen pro hodnocení OS pomocí soupravy cELISA od Antibodies.com (A86962). Plazmatické koncentrace byly vypočteny odečtením absorbance při 450 nm a odkazem na standardní křivku (rozsah 31,25-2000 pg/ml). Citlivost testu byla 18,75 pg/ml; variační koeficienty uvnitř a mezi testy byly <8 % a <10 %, v daném pořadí.

SIRT1 byl kvantifikován pomocí soupravy ELISA od Invitrogen (EH427RB). Vzorky plazmy byly před analýzou zředěny v poměru 1:2, jak uvádí výrobce. Koncentrace SIRT1 byly vypočteny odečtením absorbance při 450 nm a odkazem na standardní křivku (rozsah 1,23-300 ng/ml). Citlivost testu byla 1,23 ng/ml; variační koeficienty uvnitř a mezi testy byly <10 % a <12 %, v daném pořadí.

Provedli jsme analýzy mikroRNA na základě dostupného kvalitativně kvantitativního vzorku plazmy (N=3 v každém časovém bodě, T0, T1 a T2). MikroRNA (miR-34 a miR-124a) byly izolovány z plazmy pomocí soupravy Norgen pro izolaci celkové RNA13. Plazmatické mikroRNA a exprese spike-in cel-miR-39 byly hodnoceny pomocí testu miRNA TaqMan. K reverzní transkripci miRNA byla použita souprava pro reverzní transkripci miRNA TaqMan. Následně byla provedena RT-qPCR ve 20 μL PCR směsi obsahující 1 μL 20× TaqMan miRNA testu, který obsahoval PCR primery a sondy (5'-FAM), 10 μL 2× TaqMan Universal PCR Master Mix No Amp Erase UNG a 5 μl reverzně transkribovaného produktu. Reakce byla nejprve inkubována při 95 °C po dobu 10 minut, poté následovalo 40 cyklů při 95 °C po dobu 15 s a při 60 °C po dobu 1 minuty. Kvantitativní real-time PCR (RT-qPCR) byla provedena na ABIPRISM 7500 Real Time PCR System. Data byla analyzována pomocí 7500-systémového softwaru (1 1.4.0) s automatickým srovnávacím prahem (Ct) nastavením pro přizpůsobení základní linie. Detekční prahy byly stanoveny na 35 Ct. Relativní množství miR-34 a miR-124a byla vypočtena pomocí Ct metody: ACt = Ct (miR-34/miR-124a) - Ct (referenční miRNA); 2-ACt.