Smertestillende og antioksidanteffekter av melatonin i pediatrisk kirurgi

Melatonin viser en potensiell rolle i å beskytte nyfødte som gjennomgår kirurgi mot de skadelige effektene av oksidativt stress (OS). Etter administrering av eksogent melatonin er det rapportert en signifikant reduksjon i lipid- og proteinperoksidasjon i den postoperative perioden hos nyfødte. Nylig har Song et al. rapporterte at sirtuin 1 (SIRT1) også spiller en kritisk rolle i patogenesen av smerte, og viser smertestillende effekter ved kroniske smertetilstander som nevropatisk og inflammatorisk smerte. I denne prospektive, randomiserte, dobbeltblinde pilotstudien tester vi hypotesen om at melatonin reduserer OS og postoperativ smerte som involverer sirtuin-banen hos barn som gjennomgår kirurgi.

Melatonin (Dicoson, Dicofarm, Italia, 5 dråper = 1 mg) ble administrert oralt. Produktet er oppført i registeret over kosttilskudd på nettsiden til helsedepartementet (http://www.ministerosalute.it/alimenti/dietetica) og er klassifisert med følgende kode: 943314283. Dette produktet er underlagt det europeiske næringsmiddeldirektivet i henhold til DL n. 169 av 21. mai 2004, og ikke til det europeiske legemiddeldirektivet 2001/20/EC innført på italiensk nivå med D.L. n. 211 av 24. juni 2003. Melatoninadministrasjon har en god sikkerhetsprofil, uten kjente bivirkninger.

Melatoninplasmanivåer ble vurdert ved hvert eksperimentelle tidspunkt (T0, T1, T2) ved bruk av et konkurrerende enzymkoblet immunosorbent-assay (cELISA)-sett fra Antibodies.com (A87093) i henhold til produsentens instruksjoner. T1- og T2-plasmaprøver fra Mel-behandlede barn som mistenkes for å inneholde konsentrasjoner høyere enn den høyeste standarden (500 pg/mL), ble fortynnet 1:100 (v/v) med prøvefortynningsmiddel før analyse. Fargeutvikling ble overvåket ved 450 nm i en Thermo Scientific (MultiSkan FC) mikroplateleser, og en standardkurve (område 7,813-500 pg/ml) ble generert ved bruk av en fire-parameter logistisk (4-PL) kurvetilpasning. Sensitiviteten til analysen var 4,688 pg/ml; variasjonskoeffisientene intra- og inter-analyse var <8 % og <10 %, henholdsvis.

4-Hydroxynonenal (4-HNE) som en markør for lipidperoksidasjon ble målt for å evaluere OS ved å bruke et cELISA-sett fra Antibodies.com (A86962). Plasmakonsentrasjoner ble beregnet ved å lese absorbansen ved 450 nm og referere til standardkurven (område 31,25-2000) pg/ml). Sensitiviteten til analysen var 18,75 pg/ml; variasjonskoeffisientene intra- og inter-analyse var <8 % og <10 %, henholdsvis.

SIRT1 ble kvantifisert ved å bruke et ELISA-sett fra Invitrogen (EH427RB). Plasmaprøver ble fortynnet 1:2 som angitt av produsenten før analyse. SIRT1-konsentrasjoner ble beregnet ved absorbansavlesning ved 450 nm og med henvisning til standardkurven (område 1,23-300 ng/ml). Sensitiviteten til analysen var 1,23 ng/ml; variasjonskoeffisientene intra- og inter-analyse var <10 % og <12 %, henholdsvis.

Vi utførte mikroRNA-analyser basert på den kvali-kvantitative plasmaprøven tilgjengelig (N=3 på hvert tidspunkt, T0, T1 og T2). MikroRNA (miR-34 og miR-124a) ble isolert fra plasma ved hjelp av Norgen total RNA isolasjonssett13. Plasma mikroRNA og spike-in cel-miR-39 uttrykk ble evaluert ved hjelp av TaqMan miRNA analysen. TaqMan miRNA revers transkripsjonssett ble brukt til å reversere transkribere miRNA. Deretter ble RT-qPCR utført i 20 μL PCR-blanding inneholdende 1 μL 20x TaqMan miRNA-analyse, som inneholdt PCR-primere og prober (5'-FAM), 10 μL 2xTaqMan Universal PCR Master Mix No Amp Erase UNG og 5 μL omvendt transkribert produkt. Reaksjonen ble først inkubert ved 95 °C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser ved 95 °C i 15 s og ved 60 °C i 1 min. Den kvantitative sanntids-PCR (RT-qPCR) ble utført på et ABIPRISM 7500 Real Time PCR-system. Data ble analysert av en 7500-systemprogramvare (1 1.4.0) med den automatiske komparative terskelinnstillingen (Ct) for å tilpasse grunnlinjen. Deteksjonsterskler ble satt til 35 Ct. De relative mengder miR-34 og miR-124a ble beregnet ved å bruke Ct-metoden: ΔCt = Ct (miR-34/miR-124a) - Ct (referanse miRNA); 2-Act.