Efeitos analgésicos e antioxidantes da melatonina em cirurgia pediátrica

A melatonina mostra um papel potencial na proteção de neonatos submetidos a cirurgia dos efeitos deletérios do estresse oxidativo (EO). Após a administração de melatonina exógena, foi relatada redução significativa na peroxidação lipídica e proteica no pós-operatório em neonatos. Recentemente, Song et al. relataram que a sirtuína 1 (SIRT1) também desempenha um papel crítico na patogênese da dor, mostrando efeitos analgésicos em condições de dor crônica, como dor neuropática e inflamatória. Neste estudo piloto prospectivo, randomizado e duplo-cego, testamos a hipótese de que a melatonina reduz a OS e a dor pós-operatória envolvendo a via da sirtuína em crianças submetidas à cirurgia.

Melatonina (Dicoson, Dicofarm, Itália, 5 gotas = 1 mg) foi administrada por via oral. O produto está listado no Cadastro de Suplementos Alimentares do site do Ministério da Saúde (http://www.ministerosalute.it/alimenti/dietetica) e está classificado com o seguinte código: 943314283. Este produto está sujeito à Directiva Europeia sobre Alimentos de acordo com o DL n. 169 de 21 de maio de 2004, e não à Diretiva Europeia sobre Medicamentos 2001/20/CE transposta a nível italiano com D.L. n. 211 de 24 de junho de 2003. A administração de melatonina apresenta bom perfil de segurança, sem efeitos adversos conhecidos.

Os níveis plasmáticos de melatonina foram avaliados em cada ponto de tempo experimental (T0, T1, T2) usando um kit competitivo de ensaio imunoenzimático (cELISA) da Antibodies.com (A87093) de acordo com as instruções do fabricante. Amostras de plasma T1 e T2 de crianças tratadas com Mel suspeitas de conter concentrações superiores ao padrão mais elevado (500 pg/mL) foram diluídas 1:100 (v/v) com diluente de amostra antes da análise. O desenvolvimento da cor foi monitorado a 450 nm em um leitor de microplacas Thermo Scientific (MultiSkan FC), e uma curva padrão (faixa 7,813-500 pg/mL) foi gerada usando um ajuste de curva logística de quatro parâmetros (4-PL). A sensibilidade do ensaio foi de 4,688 pg/mL; os coeficientes de variação intra e interensaio foram <8% e <10%, respectivamente.

O 4-hidroxinonenal (4-HNE) como marcador de peroxidação lipídica foi medido para avaliar a OS usando um kit cELISA da Antibodies.com (A86962). As concentrações plasmáticas foram calculadas lendo a absorvância a 450 nm e referindo-se à curva padrão (intervalo 31,25-2000 pg/mL). A sensibilidade do ensaio foi de 18,75 pg/mL; os coeficientes de variação intra e interensaio foram <8% e <10%, respectivamente.

A SIRT1 foi quantificada utilizando um kit ELISA da Invitrogen (EH427RB). As amostras de plasma foram diluídas 1:2 conforme indicado pelo fabricante antes da análise. As concentrações de SIRT1 foram calculadas por leitura de absorbância a 450 nm e referente à curva padrão (faixa 1,23-300 ng/mL). A sensibilidade do ensaio foi de 1,23 ng/mL; os coeficientes de variação intra e interensaio foram <10% e <12%, respectivamente.

Realizamos análises de microRNA com base na amostra de plasma quali-quantitativa disponível (N = 3 em cada momento, T0, T1 e T2). MicroRNAs (miR-34 e miR-124a) foram isolados do plasma usando o kit de isolamento de RNA total Norgen13. Os microRNAs plasmáticos e as expressões de cel-miR-39 foram avaliadas usando o ensaio TaqMan miRNA. O kit de transcrição reversa TaqMan miRNA foi usado para transcrever miRNAs reversamente. Posteriormente, o RT-qPCR foi realizado em 20 μL de mistura de PCR contendo 1 μL de ensaio de miRNA 20× TaqMan, que continha primers e sondas de PCR (5'-FAM), 10 μL de 2×TaqMan Universal PCR Master Mix No Amp Erase UNG e 5 μL de produto transcrito reversamente. A reação foi primeiro incubada a 95°C por 10 min, seguida por 40 ciclos a 95°C por 15 s e a 60°C por 1 min. A PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) foi realizada em um sistema ABIPRISM 7500 Real Time PCR. Os dados foram analisados ​​por um software do sistema 7500 (1 1.4.0) com configuração de limite comparativo automático (Ct) para adaptação da linha de base. Os limites de detecção foram definidos em 35 Ct. As quantidades relativas de miR-34 e miR-124a foram calculadas usando o método Ct: ΔCt = Ct (miR-34/miR-124a) - Ct (miRNA de referência); 2-ΔCt.