Analgetische und antioxidative Wirkung von Melatonin in der Kinderchirurgie

Melatonin spielt möglicherweise eine Rolle beim Schutz von Neugeborenen, die sich einer Operation unterziehen, vor den schädlichen Auswirkungen von oxidativem Stress (OS). Nach Verabreichung von exogenem Melatonin wurde bei Neugeborenen über eine signifikante Verringerung der Lipid- und Proteinperoxidation in der postoperativen Phase berichtet. Kürzlich haben Song et al. berichteten, dass Sirtuin 1 (SIRT1) auch eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Schmerzen spielt und analgetische Wirkungen bei chronischen Schmerzzuständen wie neuropathischen und entzündlichen Schmerzen zeigt. In dieser prospektiven, randomisierten, doppelblinden Pilotstudie testen wir die Hypothese, dass Melatonin das OS und postoperative Schmerzen im Sirtuin-Signalweg bei Kindern, die sich einer Operation unterziehen, reduziert.

Melatonin (Dicoson, Dicofarm, Italien, 5 Tropfen = 1 mg) wurde oral verabreicht. Das Produkt ist im Register für Nahrungsergänzungsmittel auf der Website des Gesundheitsministeriums aufgeführt (http://www.ministerosalute.it/alimenti/dietetica). und ist mit folgendem Code klassifiziert: 943314283. Dieses Produkt unterliegt der europäischen Lebensmittelrichtlinie gemäß DL Nr. 169 vom 21. Mai 2004 und nicht der Europäischen Arzneimittelrichtlinie 2001/20/EG, die auf italienischer Ebene mit D.L. umgesetzt wurde. N. 211 vom 24. Juni 2003. Die Verabreichung von Melatonin weist ein gutes Sicherheitsprofil auf, ohne dass Nebenwirkungen bekannt sind.

Die Melatonin-Plasmaspiegel wurden zu jedem Zeitpunkt des Experiments (T0, T1, T2) mithilfe eines cELISA-Kits (Competitive Enzyme Linked Immunosorbent Assay) von Antibodies.com (A87093) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. T1- und T2-Plasmaproben von mit Mel behandelten Kindern, bei denen der Verdacht bestand, dass sie Konzentrationen über dem höchsten Standard (500 pg/ml) enthielten, wurden vor der Analyse 1:100 (v/v) mit Probenverdünnungsmittel verdünnt. Die Farbentwicklung wurde bei 450 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät von Thermo Scientific (MultiSkan FC) überwacht und eine Standardkurve (Bereich 7,813–500 pg/ml) mithilfe einer logistischen Kurvenanpassung mit vier Parametern (4-PL) erstellt. Die Empfindlichkeit des Tests betrug 4,688 pg/ml; Die Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen <8 % bzw. <10 %.

4-Hydroxynonenal (4-HNE) als Marker der Lipidperoxidation wurde zur Bewertung des OS mithilfe eines cELISA-Kits von Antibodies.com (A86962) gemessen. Die Plasmakonzentrationen wurden durch Ablesen der Absorption bei 450 nm und Bezug auf die Standardkurve (Bereich 31,25–2000) berechnet pg/ml). Die Empfindlichkeit des Tests betrug 18,75 pg/ml; Die Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen <8 % bzw. <10 %.

SIRT1 wurde mit einem ELISA-Kit von Invitrogen (EH427RB) quantifiziert. Plasmaproben wurden vor der Analyse 1:2 verdünnt, wie vom Hersteller angegeben. Die SIRT1-Konzentrationen wurden durch Absorptionsmessung bei 450 nm und unter Bezugnahme auf die Standardkurve (Bereich 1,23–300 ng/ml) berechnet. Die Empfindlichkeit des Tests betrug 1,23 ng/ml; Die Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen <10 % bzw. <12 %.

Wir führten microRNA-Analysen basierend auf der verfügbaren qualitativ-quantitativen Plasmaprobe durch (N=3 zu jedem Zeitpunkt, T0, T1 und T2). MicroRNAs (miR-34 und miR-124a) wurden mit dem Norgen Total RNA Isolation Kit13 aus Plasma isoliert. Die Plasma-microRNAs und die Spike-in-Cel-miR-39-Expression wurden mit dem TaqMan miRNA-Assay bewertet. Das TaqMan miRNA-Reverse-Transkriptionskit wurde zur Reverstranskription von miRNAs verwendet. Anschließend wurde RT-qPCR in 20 μl PCR-Mix durchgeführt, der 1 μl 20 × TaqMan miRNA-Assay enthielt, der PCR-Primer und -Sonden (5'-FAM) sowie 10 μl 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix No Amp Erase UNG enthielt und 5 μl revers transkribiertes Produkt. Die Reaktion wurde zunächst 10 Minuten lang bei 95 °C inkubiert, gefolgt von 40 Zyklen 15 Sekunden lang bei 95 °C und 1 Minute lang bei 60 °C. Die quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) wurde auf einem ABIPRISM 7500 Real Time PCR System durchgeführt. Die Daten wurden mit einer 7500-Systemsoftware (1 1.4.0) mit der automatischen Vergleichsschwelleneinstellung (Ct) zur Anpassung der Basislinie analysiert. Die Nachweisschwelle wurde auf 35 Ct festgelegt. Die relativen Mengen von miR-34 und miR-124a wurden mit der Ct-Methode berechnet: ΔCt = Ct (miR-34/miR-124a) – Ct (Referenz-miRNA); 2-ΔCt.