Effetti analgesici e antiossidanti della melatonina in chirurgia pediatrica

La melatonina mostra un potenziale ruolo nel proteggere i neonati sottoposti a intervento chirurgico dagli effetti deleteri dello stress ossidativo (OS). Dopo la somministrazione di melatonina esogena, è stata segnalata nei neonati una significativa riduzione della perossidazione lipidica e proteica nel periodo postoperatorio. Recentemente, Song et al. hanno riferito che anche la sirtuina 1 (SIRT1) svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi del dolore, mostrando effetti analgesici in condizioni di dolore cronico come il dolore neuropatico e infiammatorio. In questo studio pilota prospettico, randomizzato, in doppio cieco, testiamo l’ipotesi che la melatonina riduca l’OS e il dolore postoperatorio che coinvolge la via delle sirtuine nei bambini sottoposti a intervento chirurgico.

La melatonina (Dicoson, Dicofarm, Italia, 5 gocce = 1 mg) è stata somministrata per via orale. Il prodotto è iscritto nel Registro degli Integratori Alimentari sul sito del Ministero della Salute (http://www.ministerosalute.it/alimenti/dietetica) ed è classificato con il seguente codice: 943314283. Questo prodotto è soggetto alla Direttiva Europea sui Prodotti Alimentari secondo il DL n. 169 del 21 maggio 2004, e non alla Direttiva Europea sui Medicinali 2001/20/CE recepita a livello italiano con D.L. N. 211 del 24 giugno 2003. La somministrazione di melatonina ha un buon profilo di sicurezza, senza effetti avversi noti.

I livelli plasmatici di melatonina sono stati valutati in ogni momento sperimentale (T0, T1, T2) utilizzando un kit competitivo di test immunoassorbente legato a un enzima (cELISA) di Antibodies.com (A87093) secondo le istruzioni del produttore. I campioni di plasma T1 e T2 di bambini trattati con Mel sospettati di contenere concentrazioni superiori allo standard più elevato (500 pg/mL) sono stati diluiti 1:100 (v/v) con diluente del campione prima dell'analisi. Lo sviluppo del colore è stato monitorato a 450 nm in un lettore di micropiastre Thermo Scientific (MultiSkan FC) ed è stata generata una curva standard (intervallo 7,813-500 pg/mL) utilizzando un adattamento della curva logistica a quattro parametri (4-PL). La sensibilità del test è stata di 4,688 pg/mL; i coefficienti di variazione intra- e inter-test erano rispettivamente <8% e <10%.

Il 4-idrossinonenale (4-HNE) come marcatore della perossidazione lipidica è stato misurato per valutare l'OS utilizzando un kit cELISA di Antibodies.com (A86962). Le concentrazioni plasmatiche sono state calcolate leggendo l'assorbanza a 450 nm e facendo riferimento alla curva standard (intervallo 31,25-2000 pg/mL). La sensibilità del test era di 18,75 pg/mL; i coefficienti di variazione intra- e inter-test erano rispettivamente <8% e <10%.

SIRT1 è stato quantificato utilizzando un kit ELISA di Invitrogen (EH427RB). I campioni di plasma sono stati diluiti 1:2 come indicato dal Produttore prima dell'analisi. Le concentrazioni di SIRT1 sono state calcolate mediante lettura dell'assorbanza a 450 nm e facendo riferimento alla curva standard (intervallo 1,23-300 ng/mL). La sensibilità del test era di 1,23 ng/mL; i coefficienti di variazione intra- e inter-test erano rispettivamente <10% e <12%.

Abbiamo eseguito analisi dei microRNA sulla base del campione di plasma quali-quantitativo disponibile (N = 3 in ciascun punto temporale, T0, T1 e T2). I microRNA (miR-34 e miR-124a) sono stati isolati dal plasma utilizzando il kit di isolamento dell'RNA totale Norgen13. I microRNA plasmatici e le espressioni spike-in di cel-miR-39 sono stati valutati utilizzando il test TaqMan miRNA. Il kit di trascrizione inversa TaqMan miRNA è stato utilizzato per la trascrizione inversa dei miRNA. Successivamente, la RT-qPCR è stata eseguita in 20 μL di miscela PCR contenente 1 μL di 20×TaqMan miRNA assay, che conteneva primer e sonde PCR (5'-FAM), 10 μL di 2×TaqMan Universal PCR Master Mix No Amp Erase UNG e 5 μL di prodotto trascritto in modo inverso. La reazione è stata prima incubata a 95°C per 10 minuti seguita da 40 cicli a 95°C per 15 s e a 60°C per 1 minuto. La PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) è stata eseguita su un sistema ABIPRISM 7500 Real Time PCR. I dati sono stati analizzati da un software del sistema 7500 (1 1.4.0) con l'impostazione della soglia comparativa automatica (Ct) per adattare la linea di base. Le soglie di rilevamento sono state fissate a 35 Ct. Le quantità relative di miR-34 e miR-124a sono state calcolate utilizzando il metodo Ct: ΔCt = Ct (miR-34/miR-124a) - Ct (miRNA di riferimento); 2-ΔCt.