Przeciwbólowe i przeciwutleniające działanie melatoniny w chirurgii dziecięcej

Melatonina wykazuje potencjalną rolę w ochronie noworodków poddawanych zabiegom chirurgicznym przed szkodliwym działaniem stresu oksydacyjnego (OS). Po podaniu egzogennej melatoniny odnotowano u noworodków istotne zmniejszenie peroksydacji lipidów i białek w okresie pooperacyjnym. Ostatnio Song i wsp. podali, że sirtuina 1 (SIRT1) odgrywa również kluczową rolę w patogenezie bólu, wykazując działanie przeciwbólowe w przewlekłych stanach bólowych, takich jak ból neuropatyczny i zapalny. W tym prospektywnym, randomizowanym badaniu pilotażowym z podwójnie ślepą próbą testujemy hipotezę, że melatonina zmniejsza OS i ból pooperacyjny z udziałem szlaku sirtuiny u dzieci poddawanych operacji.

Melatoninę (Dicoson, Dicofarm, Włochy, 5 kropli = 1 mg) podawano doustnie. Produkt znajduje się w Rejestrze Suplementów Diety na stronie internetowej Ministerstwa Zdrowia (http://www.ministerosalute.it/alimenti/dietetica) i jest sklasyfikowany pod następującym kodem: 943314283. Ten produkt podlega europejskiej dyrektywie dotyczącej środków spożywczych zgodnie z DL n. 169 z dnia 21 maja 2004 r., a nie do Europejskiej Dyrektywy o Lekach 2001/20/EC transponowanej na poziomie włoskim przez D.L. N. 211 z 24 czerwca 2003 r. Podawanie melatoniny ma dobry profil bezpieczeństwa i nie są znane żadne działania niepożądane.

Poziomy melatoniny w osoczu oceniano w każdym doświadczalnym punkcie czasowym (T0, T1, T2) przy użyciu zestawu kompetycyjnego testu immunoenzymatycznego (cELISA) z Antibodies.com (A87093) zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki osocza T1 i T2 od dzieci leczonych Mel, co do których istnieje podejrzenie, że zawierają stężenia wyższe niż najwyższy standard (500 pg/ml), przed analizą rozcieńczono 1:100 (v/v) rozcieńczalnikiem do próbek. Rozwój koloru monitorowano przy 450 nm w czytniku mikropłytek Thermo Scientific (MultiSkan FC) i wygenerowano krzywą standardową (zakres 7,813-500 pg/ml) przy użyciu czteroparametrowego dopasowania krzywej logistycznej (4-PL). Czułość testu wyniosła 4,688 pg/ml; współczynniki zmienności wewnątrz- i międzytestowej wynosiły odpowiednio <8% i <10%.

Zmierzono 4-hydroksynonenal (4-HNE) jako marker peroksydacji lipidów w celu oceny OS przy użyciu zestawu cELISA z Antibodies.com (A86962). Stężenia w osoczu obliczono odczytując absorbancję przy 450 nm i odnosząc się do krzywej standardowej (zakres 31,25-2000 pg/ml). Czułość testu wyniosła 18,75 pg/ml; współczynniki zmienności wewnątrz- i międzytestowej wynosiły odpowiednio <8% i <10%.

SIRT1 określono ilościowo przy użyciu zestawu ELISA firmy Invitrogen (EH427RB). Próbki osocza przed analizą rozcieńczono w stosunku 1:2 zgodnie z zaleceniami producenta. Stężenia SIRT1 obliczono na podstawie odczytu absorbancji przy 450 nm i odnosząc się do krzywej standardowej (zakres 1,23-300 ng/ml). Czułość testu wyniosła 1,23 ng/ml; współczynniki zmienności wewnątrztestowej i międzytestowej wynosiły odpowiednio <10% i <12%.

Przeprowadziliśmy analizy mikroRNA w oparciu o dostępną jakościowo-ilościową próbkę osocza (N = 3 w każdym punkcie czasowym, T0, T1 i T2). MikroRNA (miR-34 i miR-124a) wyizolowano z osocza przy użyciu zestawu do izolacji całkowitego RNA Norgen13. MikroRNA w osoczu i ekspresję spike-in cel-miR-39 oceniano przy użyciu testu miRNA TaqMan. Do odwrotnej transkrypcji miRNA zastosowano zestaw do odwrotnej transkrypcji miRNA TaqMan. Następnie przeprowadzono RT-qPCR w 20 µl mieszanki PCR zawierającej 1 µl 20 x testu miRNA TaqMan, który zawierał startery i sondy PCR (5'-FAM), 10 µl 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix No Amp Erase UNG i 5 µl produktu poddanego odwrotnej transkrypcji. Reakcję najpierw inkubowano w temperaturze 95°C przez 10 minut, następnie wykonano 40 cykli w temperaturze 95°C przez 15 sekund i w temperaturze 60°C przez 1 minutę. Ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) przeprowadzono w systemie ABIPRISM 7500 Real Time PCR. Dane analizowano za pomocą oprogramowania systemu 7500 (1 1.4.0) z ustawieniem automatycznego progu porównawczego (Ct) w celu dostosowania linii bazowej. Progi wykrywalności ustalono na 35 Ct. Względne ilości miR-34 i miR-124a obliczono stosując metodę Ct: ΔCt = Ct (miR-34/miR-124a) - Ct (miRNA odniesienia); 2-ΔCt.