Podpisy tkáňového mikroprostředí mycetomového granulomu

Mycetom je chronické, specifické, subkutánní granulomatózní, progresivní a znetvořující zánětlivé onemocnění. Je způsobena skutečnými houbami nebo určitými bakteriemi, a proto se obvykle dělí na eumycetom a aktinomycetom. Madurella mycetomatis je nejčastějším původcem eumycetomu, zatímco Streptomyces somaliensis a Nocardia brasiliensis jsou běžnými původci aktinomycetomu. Patognomická pro mycetom je triáda nebolestivé podkožní hmoty, tvorba sinusů a hnisavý nebo séropnisavý výtok obsahující zrna. Zánětlivý subkutánní granulom se obvykle šíří do kůže a hlubokých struktur, což vede k destrukci, deformaci a ztrátě funkce, někdy může být smrtelné. Noha a ruka jsou nejčastěji postiženými místy pozorovanými v 82 % případů. V endemických oblastech mohou být postiženy další části těla, jako je koleno, paže, noha, hlava a krk, stehno a hráze. U mycetomu není vyloučen žádný věk; vyskytuje se však častěji u mladých dospělých mužů ve věkovém rozmezí 20-40 let a téměř 30 % hlášených pacientů byli mladí studenti.

Skutečná incidence a prevalence mycetomu na celém světě není přesně známa. Je zajímavé poznamenat, že většina hlášených údajů o mycetomu se vztahuje k nemocničním pacientům s pokročilým onemocněním. Je to způsobeno povahou mycetomu, který je obvykle nebolestivý, pomalu progredující a pozdní diagnostika většiny pacientů z důvodu špatné zdravotní výchovy, nedostatku zdravotnických zařízení a finančních omezení.

Celosvětová distribuce mycetomu se velmi liší. Je endemický v mnoha tropických a subtropických oblastech a převládá v mycetomovém pásu, který zahrnuje země Súdán, Somálsko, Senegal, Indie, Jemen, Mexiko, Venezuela, Kolumbie, Argentina a několik dalších. Zdá se, že největší zátěž a prevalenci onemocnění má africký kontinent. To bylo také značně hlášeno z Indie. Nicméně, mycetom byl hlášen také v mnoha mírných oblastech. Existuje několik zpráv o mycetomu z USA, Srí Lanky, Německa, Egypta, Turecka, Filipín, Japonska, Libanonu, Thajska, Saúdské Arábie, Tuniska a Íránu.

Správná léčba mycetomu závisí především na přesné diagnóze. Nezbytná je identifikace původce na druhové úrovni a současné testy pro to jsou klasická kultivace zrn, chirurgická biopsie, histopatologické vyšetření a různé molekulární techniky, jako je PCR. K určení rozsahu onemocnění se používají různé zobrazovací techniky, jako je konvenční radiologie, ultrasonografie, CT sken a MRI. Většina těchto testů a technik je invazivních, drahých a s nízkou senzitivitou a specificitou. Kromě toho nejsou dostupné v endemických oblastech mycetomu, a proto existuje zoufalá potřeba snadno použitelného testu vhodného pro pole k identifikaci původce.

Zvládání této tíživé a zničující nemoci je zklamáním. Léčba závisí především na etiologickém agens, místě a rozsahu onemocnění. Až donedávna byla jedinou dostupnou léčbou mycetomu amputace nebo mnohočetné mutilující znetvořující chirurgické excize. Zlatým standardem u mycetomu je kombinovaná medikamentózní léčba ve formě antimykotik u eumycetomu a antibiotik a antimikrobiálních látek u aktinomycetomu a různých chirurgických excizí.

Zprávy o lékařské léčbě u eumycetomu jsou vzácné a nedostatečné. V průběhu let až do současnosti byla léčba eumycetomu založena spíše na osobních klinických zkušenostech a na výsledcích sporadických kazuistik než na kontrolovaných klinických studiích. Obecně je u eumycetomu léčbou první volby masivní chirurgická excize nebo amputace postižené části. S malým úspěchem byla vyzkoušena různá antifungální činidla. To je možná překvapivé, protože původci eumycetomu jsou infekční organismy nízkého stupně a jejich vymýcení by mělo být snadno dosaženo podáváním antimykotik. Obecně je aktinomycetom přístupný lékařské léčbě antibiotiky a jinými chemoterapeutickými činidly. Kombinovaná léková terapie je vždy upřednostňována před jedním lékem, aby se zabránilo lékové rezistenci a eradikaci onemocnění.

Medikamentózní léčba u obou typů mycetomu musí pokračovat, dokud není pacient klinicky, radiologicky, ultrazvukově a cytologicky vyléčen. Recidiva je častější po neúplné nebo nepravidelné léčbě. Při non-compliance pacienta existuje velká šance, že si organismus vyvine lékovou rezistenci.

Studie byla provedena na klinice Mycetoma v Mycetoma Research Center (MRC), Chartúm Súdán. Pacienti byli do studie zařazeni po obdržení písemného informovaného souhlasu v souladu s Helsinskou deklarací.

Pacienti byli rozděleni do tří skupin;

• Pacienti s eumycetomovými lézemi (n=10)
• Pacienti s aktinomycetomovými lézemi (n=12)
• Pacienti s lézemi s neznámou kauzalitou (n=6)

Fixace formalínem a zalití parafínem bylo provedeno na MRK podle standardních postupů.

Jemné jehlové aspiráty (FNA) byly odebrány pro průtokovou cytometrii ve stejnou dobu a na stejném místě léze v těle.

Aspiráty byly zmraženy při -80 °C pro budoucí analýzu. Současně bylo každému pacientovi odebráno 15 ml krve na imunologické funkční testy.

Mononukleární buňky periferní krve byly připraveny pomocí standardních protokolů a skladovány v kapalném dusíku až do potřeby.

5 ml krve bylo odebráno do zkumavek Paxgene pro transkriptomickou analýzu.

Imunohistochemie Imunohistochemie byla provedena na University of York, UK. Řezy zalité v parafínu (FFPE) zafixované ve formalínu byly analyzovány pomocí 700 genu Nanostring PanCancer Immune Cell profiling panel, aby se získal pohled na vysokou úroveň imunitního/zánětlivého podpisu.

Sériové řezy byly podrobeny vysoce multiplexnímu barvení protilátek pomocí systému digitálního prostorového profilování Nanostring, aby se získal komplexní a prostorově rozlišený náhled na mikroprostředí lézí.

Kandidátní cíle pan-mycetomu identifikované těmito přístupy byly potvrzeny použitím imunofluorescenčních protilátek a RNA-fluorescenční in situ hybridizace.

Všechna data byla zaznamenána jako digitalizované celé snímky pro publikaci a archivaci.

Antigenově specifické odpovědi T buněk Analýza odpovědí T buněk byla provedena v Institutu pro endemické nemoci, Univerzita v Chartúmu.

Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) od pacientů a zdravé kontroly odpovídající věku a pohlaví z endemické oblasti byly stimulovány po dobu 7 dnů houbovými a bakteriálními lyzáty. Odezvy IFN, IL-17, IL-4 a IL-10 byly stanoveny testem ELISPOT.

Průtoková cytometrie na FNB byla provedena s panely protilátek pro hodnocení fenotypu T buněk a myeloidních buněk.

Transkriptomika plné krve Krev byla odebrána do Paxgene a skladována při -80 °C. RNA byla extrahována ze skladovaných vzorků Úplná transkriptomická data plné krve byla získána pomocí RNA-Seq.

Měření cytokinů v mycetomových aspirátech byla provedena pomocí komerčně dostupných souprav ELISA.