Vícelékový protokol desenzibilizace pro kandidáty na transplantaci srdce

Kandidáti na transplantaci s HLA aloprotilátkami jsou vystaveni vysokému riziku protilátkami zprostředkované rejekce (AMR), selhání štěpu a akutní rejekce (1,2). Při transplantaci srdce vedou tyto komplikace ke smrti. Práh 50% vypočtené panelové reaktivní protilátky, CPRA, je vybrán z konsenzuálního prohlášení Mezinárodní společnosti pro transplantaci srdce a plic (3). Tato hodnota je sice svévolná, ale představuje konsenzus uznávaného názoru mezi zkušenými a renomovanými centry pro transplantaci srdce.

Aloprotilátky, které těmto pacientům brání v transplantaci, jsou výsledkem adaptivního imunitního systému a imunologické paměti. Imunologická paměť je definována jako schopnost imunitního systému poskytnout rychlejší, silnější a specifičtější odpověď na druhou expozici antigenu, kdy byl antigen po předchozí expozici zcela vyloučen z organismu.

Na imunologické paměti se podílejí tři hlavní buněčné linie: paměťové T buňky, paměťové B buňky a plazmatické buňky, z nichž všechny mohou přežít, jakmile je antigen eliminován (4). B buňky mohou reagovat na malé rozpustné antigeny i velké antigeny (5). Jakmile se B buňka aktivuje, může se stát krátkodobou plazmatickou buňkou a produkovat imunoglobulin M (IgM), protilátky nebo může vstoupit do germinálního centra, kde může podstoupit somatickou hypermutaci s afinitním zráním a změnou izotypů. B buňka se pak může diferencovat na dlouho žijící plazmatickou buňku a soutěžit o výklenek kostní dřeně nebo se může stát paměťovou B buňkou (4-8).

Paměťové T buňky mohou přetrvávat po celý život a mohou recirkulovat mezi sekundárními lymfoidními orgány (SLO) jako centrální paměťové T buňky (TCM) nebo v periferních tkáních jako efektorové paměťové T buňky (TEM) (4,9). Po setkání s jejich příbuzným antigenem mohou rychle proliferovat a diferencovat se na efektorové T buňky.

Paměťové B-buňky se pomalu množí a recirkulují v SLO, vydrží tam desítky let a bylo zaznamenáno, že paměťové B-buňky až vaccinia (neštovice) přežívají déle než 50 let (9). Jsou běžně identifikovány přítomností CD27 a po druhé antigenní expozici; paměťové B buňky mohou rychle proliferovat a poté se diferencovat na nové plazmatické buňky (10). Tento jev poskytuje redundantní systém nebo "pole" pro doplňování plazmatických buněk, které produkují protilátku pro daný antigen.

Plazmatické buňky jsou vysoce diferencované a specifické buňky, které mohou aktivně produkovat aloprotilátky. Existují dvě populace plazmatických buněk, krátkodobá a dlouhověká (8). Plazmatické buňky s dlouhou životností mohou přetrvávat po celý život a mohou se objevit během méně než 1 týdne po antigenní stimulaci (6,7). V jádrových biopsiích příjemců transplantátu ledviny byly během akutní rejekce identifikovány B buňky, paměťové B buňky, plazmablasty a plazmatické buňky (11). Plazmatické buňky jsou koncově diferencované, a proto nemohou proliferovat. V kostní dřeni existuje konečný počet výklenků pro přežití (109) závislých na počtu přítomných stromálních buněk, které je podporují. Plazmatické buňky, které nenaleznou útočiště v kostní dřeni nebo útočiště ztratí, vydrží pouze několik dní, pravděpodobně kvůli intenzivním metabolickým nárokům buňky, která může produkovat 10 000 až 20 000 kopií protilátky za sekundu (12). V současné době se předpokládá, že plazmatické buňky nemají negativní zpětnovazební smyčku k potlačení syntézy protilátek. Bylo prokázáno, že plazmatické buňky mají FcyRIIB receptor spojený s imunoreceptorovým tyrosinovým inhibičním motivem (ITIM) (13). Receptor FcyRIIB je receptor s nízkou afinitou a nemůže vázat monomerní imunoglobulin G (IgG). Předpokládá se, že za homeostázu imunoglobulinu zodpovídá především endoteliální buňka (14). Jakmile je protilátka produkována, endoteliální buňky mohou eliminovat cirkulující protilátku lysozomální degradací nebo recyklací protilátky prostřednictvím neonatálního (FcRn) receptoru závislého mechanismu zpět do plazmy.

Úspěšný plán na odstranění paměti daného antigenního setkání se musí zabývat třemi samostatnými systémy nebo „polemi“. Odstranění imunologické paměti tak, aby bylo možné odstranit škodlivé protilátky a poté vytvořit nové příznivé protilátky, by bylo významným pokrokem v oblasti transplantací a autoimunity. Přehled léků používaných v IND 110875 objasní, proč může být tento protokol úspěšný tam, kde všechny ostatní selhaly.

Králičí antithymocytární globulin, RATG, má vlastnosti anti-T-buněk, a zejména aktivitu proti povrchovým antigenům paměťových T-buněk, čímž způsobuje komplementem zprostředkovanou smrt T-buněk v periferní krvi a apoptózu ve slezině a lymfatických uzlinách (15). RATG má protilátky proti CD27, CD38, HLA-DR a prokázal vlastnosti proti paměťovým B lymfocytům in vitro a in vivo (15-17). Kombinace rATG a rituximabu snížila CD27 pozitivní B buňky ze sleziny u pacientů v desenzibilizační studii, která byla jinak neúspěšná, bylo významným pozorováním (16).

Rituximab, anti-CD20 monoklonální protilátka, má silnou aktivitu proti B-buňkám a vyčerpává B-buňky v oběhu po dobu 5-7 měsíců. Ale jak se B-buňky diferencují na plazmatické buňky, povrchový marker CD20 je down-regulován, se současnou ztrátou citlivosti na rituximab (18). Rituximab se používá u řady autoimunitních onemocnění (19,20). Mnoho protilátek není ovlivněno, zatímco jiné jsou po určitou dobu sníženy. Krátkodobé plazmatické buňky mohou být sníženy, protože po jejich krátkém třídenním poločasu rozpadu není připravena zásoba B lymfocytů, které by je nahradily. Ve studii systémové lupus erythematosis (SLE) s použitím rituximabu; průtoková cytometrie a studie specificity autoprotilátek odhalily, že protilátky proti Ro52 a La44 a spalničkám nebyly sníženy, ale protilátky proti dsDNA a C1q se snížily (19). Celkové množství imunoglobulinu se nezměnilo. Plazmatické buňky nejsou ovlivněny anti-CD20, takže produkce protilátek z plazmatických buněk s dlouhou životností pokračuje bez omezení. Paměťové B-buňky jsou CD 27+ a mají variabilní expresi CD20. Studie u kandidátů na desenzibilizující transplantaci ledvin ukázala, že rituximab nesnížil počet CD27+ paměťových B buněk nebo plazmatických buněk ve slezině (16). U pacientů (SLE) léčených rituximabem byly buňky vracející se po depleci převážně naivní B buňky a plazmablasty byly 2,3krát vyšší než na začátku (19). Zatímco paměťové B buňky cirkulující v krvi byly po terapii rituximabem nižší, paměťové B buňky ve slezině se zdají být neovlivněné a mohou se pak transformovat na plazmablasty, které pak mohou vylučovat rozpustnou protilátku. Toto pozorování vysvětluje, proč některé protilátky zmizí, alespoň dočasně s rituximabem, zatímco jiné ne. Pokud protilátka pochází primárně z plazmatických buněk s krátkou životností nebo plazmablastů, bude mít pravděpodobnější účinek rituximab; tyto protilátky jsou produkovány buňkami s krátkým poločasem života a jsou závislé na kontinuální proliferaci B buněk. Protilátky produkované plazmatickými buňkami s dlouhou životností nejsou rituximabem ovlivněny. Rituximab neovlivňuje paměťové B buňky ve slezině, takže mohou rychle reformovat plazmablasty a plazmatické buňky a rekonstituovat buněčné linie produkující určité klony protilátek. Protože paměťové B-buňky se mohou stát plazmatickými buňkami vylučujícími protilátky, je výhodné je před transplantací u vysoce senzibilizovaného pacienta odstranit.

Bylo prokázáno, že kombinace rATG a rituximabu u člověka snižuje paměťové B buňky ve slezině (16). Toto zjištění dosud nebylo začleněno do desenzibilizačního protokolu nebo do protokolu pro autoimunitní terapie z našeho přehledu literatury. Žádná jiná terapie účinně redukuje paměťové B buňky u člověka a představuje nový aspekt IND 110875.

Žádná činidla dříve používaná při transplantacích, včetně rATG a rituximabu, nemají schopnost inhibovat zralé plazmatické buňky, jakmile najdou útočiště v kostní dřeni, a proto mají malý účinek na snížení produkce protilátek. Bortezomib, inhibitor proteazomu používaný při léčbě mnohočetného myelomu, má však schopnost vyčerpávat plazmatické buňky prostřednictvím mnoha mechanismů.

Inhibice proteazomu představuje novou léčebnou strategii, protože poskytuje prostředek pro vyčerpání plazmatických buněk v kostní dřeni (21,22). Bortezomib je schválen pro použití v léčbě mnohočetného myelomu a citlivost myelomových buněk na inhibitory proteazomu je úměrná jejich rychlosti syntézy imunoglobulinů (22). Je známo, že plazmatické buňky mají vysokou rychlost syntézy imunoglobulinů a léčba bortezomibem po 48 hodinách léčby na myším modelu BALB/c vyčerpávala plazmatické buňky s krátkou i dlouhou životností o více než 60 % ve slezině a 95 % v kostní dřeni . Bortezomib aktivoval rozloženou proteinovou odpověď (UPR) dokumentovanou zvýšením exprese chaperonů BiP a Chop, které jsou markery pro UPR. Autoři také došli k závěru, že pozdní inhibice antiapoptotického transkripčního faktoru NF-κB také přispěla k buněčné smrti. V myším modelu lupusové nefritidy (myši NZB/W F1) léčených bortezomibem se protilátky specifické pro dsDNA snížily na rozsah neautoimunitních myší. Celkové koncentrace IgG, IgG2a, IgG3, IgM a IgA v séru byly všechny silně sníženy, ale koncentrace IgG1 a IgG2 se nezměnily nebo se změnily jen mírně (21). Celkové koncentrace IgG nebyly sníženy o více než 50 %. Autoři poznamenali, že nově vytvořené plazmatické buňky se mohly vrátit do 48 hodin po injekci bortezomibu. Tato zjištění podporují závěr, že bortezomib může zabíjet plazmatické buňky a má blahodárný klinický účinek, ale paměťové B lymfocyty nejsou vyčerpány a plazmatické buňky se mohou rychle zotavit a produkovat nežádoucí protilátky. Schopnost bortezomibu zabíjet nemaligní plazmatické buňky představuje hlavní zjištění s potenciální terapeutickou účinností při transplantacích a autoimunitních onemocněních, ale sama o sobě není schopna dlouhodobého snížení protilátek. Klinický nález variabilního snížení hladin protilátek u bortezomibu lze vysvětlit z těchto nálezů v základní vědecké literatuře.

Bortezomib byl použit jako záchranná strategie pro léčbu rejekce zprostředkované refrakterními protilátkami (23-25). Studie in vitro odhalila, že bortezomib byl schopen vyvolat apoptózu v plazmatických buňkách aspirovaných příjemcům transplantátu ledviny, zatímco rATG, rituximab a IVIG nezpůsobily apoptózu (25). Bylo prokázáno, že léčba bortezomibem v koncentracích, které blokují produkci protilátek in vitro, významně snižuje aktivitu chymotrypsinu podobné peptidázy 20S proteazomu. U dvou pacientů byla provedena biopsie kostní dřeně během akutní humorální rejekce, jeden týden po bortezomibu a jeden rok později, což odhalilo, že celkový počet alospecifity plazmatických buněk se snížil, stejně jako celkové procento plazmatických buněk (25). Ne všechny protilátky byly sníženy bortezomibem u těchto dvou pacientů a celkové hladiny IgG byly nezměněny, přesto tato studie ukázala, že bortezomib může snížit plazmatické buňky v kostní dřeni.

Bortezomib je indikován pro mnohočetný myelom, kde maligní plazmatické buňky jsou velmi agresivní při produkci protilátek. Čím produktivnější je myelomová buněčná linie při tvorbě protilátky, tím je náchylnější k inhibici proteazomu (22). Výše uvedená literatura u nemaligních plazmatických buněk také ukazuje, že jsou citlivé na inhibici proteazomu bortezomibem, ale v řadě studií se určité imunoglobulinové frakce nesnížily a celková množství imunoglobulinu se nezměnila. Plazmatické buňky možná nejsou tak metabolicky aktivní jako jejich maligní protějšky. Existují určité důkazy, že plazmatické buňky mohou být schopny snižovat svou syntézu imunoglobulinů, což by je naopak učinilo méně náchylnými k proteasomální inhibici (26). Opětovné vyšetření homeostázy imunoglobulinů odhaluje potenciální terapii ke zvýšení citlivosti na bortezomib.

Imunoglobulinová homeostáza je z velké části pociťována jako výsledek produkce plazmatických buněk a poté FcRn zprostředkované recyklace v endoteliálních buňkách. Protilátka, která se nekombinuje s FcRn v endozomu endoteliální buňky, je pak degradována, zatímco protilátka, která se nekombinuje, je recyklována zpět do intersticiálního prostoru (27). Koncept, že IgG nemá negativní zpětnovazební smyčku k plazmatické buňce, je podpořen daty na experimentálních zvířatech a lidech (28,29). Klinickí lékaři však pozorují pacienty, kteří se po plazmaferéze „obrátí“ s hladinami protilátek, které byly stejně vysoké nebo vyšší než před plazmaferézou, což vedlo k závěru, že existuje negativní zpětná vazba (30,31). Rebound fenomén byl vysvětlen jako návrat protilátky z periferie a zvýšená recyklace FcRn receptory (28). Regulaci syntézy proteinů v plazmatické buňce se dostalo nové pozornosti a je řízena komplexním systémem zpětnovazebních smyček zahrnujících stres endoplazmatického retikula a signalizaci mTOR (32).

Nedávné výzkumy mechanismu funkce intravenózního imunoglobulinu, IVIG, nabízejí další pohled na možné vysvětlení negativní zpětné vazby k plazmatickým buňkám. V klinické literatuře se předpokládá, že IVIG funguje řadou cest včetně antiidiotypických protilátek, inhibice aktivace cytokinového genu, aktivity anti-T buněčných receptorů, anti CD4 aktivity, stimulace antagonistů cytokinových receptorů, inhibice aktivity komplementu a Fc zprostředkované interakce s buňkami prezentujícími antigen k blokování aktivace T buněk (33). Nedávná práce ukazuje, že tyto mechanismy jsou možná chybné. Studie u dětí s ITP v roce 1993 odhalily, že infuze Fc fragmentů poskytuje protizánětlivé vlastnosti (34). Protizánětlivé vlastnosti IVIG lze nyní připsat Fc sialylaci IgG (35-37). Imunoglobuliny jsou glykoproteiny a jeden N-vázaný glykan se nachází na Asn297 v Fc doméně. Tento kovalentně vázaný komplexní glykan je složen z biantenárního heptapolysacharidu obsahujícího N-acetylglukosamin a manózu a dva terminální zbytky kyseliny sialové (35). Další modifikace této sacharidové struktury jsou běžné a na tomto jednom místě bylo identifikováno více než 30 různých glykanů a pro vazbu FcyR je povinná glykosylace IgG. Celková protizánětlivá aktivita IVIG závisí na sialylaci IgG Fc fragmentů a to představuje pouze 5 % IgG poolu. Malé množství sialylovaného IgG v IVIG vysvětluje, proč jsou pro jeho protizánětlivé účinky nutné velké dávky, zatímco k léčbě hypogamaglobulinémie jsou zapotřebí mnohem nižší dávky. Plazmaferéza může snížením sialylovaného IgG vést k up-regulaci syntézy protilátek v plazmatických buňkách a učinit je citlivějšími na bortezomib.

Indexový pacient léčený protokolem podobným tomuto, pacient měl účinnou deleci (< 5000 MFI) všech svých protilátek detekovaných pomocí LABScreen, včetně protilátek třídy II, které bylo před tím obtížné odstranit. Při použití mnohem přísnějších kritérií < 1000 MFI měl pacient s indexem pouze jednu zbývající protilátku nad 1000 na konci 3 cyklů fáze léčby bortezomibem. Pacient byl jedinečný mezi kazuistikami terapií protilátkami zprostředkované rejekce a desenzibilizační terapie v tom, že všechny pacientovy protilátky dramaticky poklesly a celkové množství rozpustné protilátky se snížilo do bodu, kdy pacient vyžadoval IVIG pro substituční terapii. Pokud je tento výsledek reprodukovatelný a protokol má dostatečnou bezpečnost, pak by tyto výsledky mohly mít důležité důsledky v oblasti transplantací a autoimunitních onemocnění. Nemoci zprostředkované autoprotilátkami mohou mít nyní potenciál vyléčit, pokud je vymazána imunologická paměť vyvolávajících epitopů.

Vzhledem k nadbytečné povaze imunologické paměti je nemožné studovat tyto léky obvyklou metodologií jednoho léku za druhým. Potenciální riziko protokolu je přijatelné pouze z důvodu potřeby vyvinout účinnou terapii pro život ohrožující situaci. Tento protokol je v souladu s kritérii objasněnými FDA v nedávném článku New England Journal of Medicine, „Development of Novel Combination Therapies“ (38). Článek popisuje především kombinační terapie pro studie rakoviny; tematické složky dokumentu se však vztahují na IND 110875.