Protocollo di desensibilizzazione multi-farmaco per candidati al trapianto di cuore

I candidati al trapianto con alloanticorpi HLA sono ad alto rischio di rigetto mediato da anticorpi (AMR), fallimento del trapianto e rigetto acuto (1,2). Nel trapianto di cuore, queste complicazioni portano alla morte. La soglia del 50% calcolata per l'anticorpo reattivo del pannello, CPRA, viene scelta da una dichiarazione di consenso dell'International Society of Heart and Lung Transplantation (3). Questo valore è certamente arbitrario, ma rappresenta un consenso di opinione accettata tra centri di trapianto di cuore esperti e rispettabili.

Gli alloanticorpi che impediscono a questi pazienti di essere trapiantati sono il risultato del sistema immunitario adattativo e della memoria immunologica. La memoria immunologica è definita come la capacità del sistema immunitario di fornire una risposta più rapida, più forte e più specifica a una seconda esposizione di un antigene, quando l'antigene è stato completamente eliminato dall'organismo dopo la precedente esposizione.

Ci sono tre principali linee cellulari coinvolte nella memoria immunologica: cellule T di memoria, cellule B di memoria e plasmacellule, che possono tutte sopravvivere una volta che l'antigene è stato eliminato (4). Le cellule B possono produrre risposte sia a piccoli antigeni solubili che a grandi antigeni (5). Una volta che una cellula B si attiva, può diventare una plasmacellula di breve durata e produrre immunoglobulina M, (IgM), anticorpi o può entrare in un centro germinale dove può subire ipermutazione somatica con maturazione dell'affinità e cambio di isotipo. La cellula B può quindi differenziarsi in una plasmacellula longeva e competere per una nicchia del midollo osseo o può diventare una cellula B della memoria (4-8).

Le cellule T della memoria possono durare una vita e possono ricircolare tra gli organi linfoidi secondari (SLO) come cellule T della memoria centrale (TCM) o nei tessuti periferici come cellule T della memoria effettrici (TEM) (4,9). Dopo aver incontrato il loro antigene affine, possono proliferare rapidamente e differenziarsi in cellule T effettrici.

Le cellule B della memoria proliferano lentamente e ricircolano negli SLO, durano lì per decenni e si è notato che le cellule B della memoria per il vaccino (vaiolo) sopravvivono per più di 50 anni (9). Sono comunemente identificati dalla presenza di CD27 e da un secondo challenge antigenico; le cellule B della memoria possono proliferare rapidamente e quindi differenziarsi in nuove plasmacellule (10). Questo fenomeno fornisce un sistema ridondante o "array" per ricostituire le plasmacellule che producono anticorpi per un dato antigene.

Le plasmacellule sono cellule altamente differenziate e specifiche che possono produrre attivamente alloanticorpo. Esistono due popolazioni di plasmacellule, a vita breve ea vita lunga (8). Le plasmacellule a vita lunga possono durare per tutta la vita e possono comparire entro meno di 1 settimana dalla stimolazione antigenica (6,7). Nelle biopsie del nucleo dei riceventi di trapianto di rene, durante i rigetti acuti sono stati identificati tutti i linfociti B, i linfociti B della memoria, i plasmablasti e le plasmacellule (11). Le plasmacellule sono differenziate e quindi non possono proliferare. Nel midollo osseo esiste un numero finito di nicchie di sopravvivenza (109) dipendenti dal numero di cellule stromali presenti per sostenerle. Le plasmacellule che non trovano rifugio nel midollo o perdono rifugio durano solo pochi giorni, probabilmente a causa delle intense richieste metaboliche di una cellula che può produrre tra le 10.000 e le 20.000 copie di anticorpi al secondo (12). Attualmente si pensa che le plasmacellule siano prive di un ciclo di feedback negativo per sopprimere la loro sintesi di anticorpi. È stato dimostrato che le plasmacellule hanno un recettore FcγRIIB accoppiato a un motivo inibitorio basato sulla tirosina dell'immunorecettore (ITIM) (13). Il recettore FcγRIIB è un recettore a bassa affinità e non può legare l'immunoglobulina monomerica G, (IgG). Si ritiene che l'omeostasi delle immunoglobuline sia principalmente responsabilità della cellula endoteliale (14). Una volta prodotto un anticorpo, le cellule endoteliali possono eliminare l'anticorpo circolante mediante degradazione lisosomiale o riciclando l'anticorpo attraverso un meccanismo dipendente dal recettore Fc neonatale (FcRn) nel plasma.

Un piano di successo per eliminare la memoria di un dato incontro antigenico deve affrontare i tre sistemi separati o "array". L'eliminazione della memoria immunologica tale da poter rimuovere gli anticorpi deleteri e quindi creare nuovi anticorpi favorevoli sarebbe un progresso significativo nei campi del trapianto e dell'autoimmunità. Una revisione dei farmaci utilizzati in IND 110875 chiarirà perché questo protocollo può avere successo dove tutti gli altri hanno fallito.

La globulina antitimocitica di coniglio, RATG, ha proprietà anti-cellule T e, in particolare, attività contro gli antigeni di superficie delle cellule T memoria, causando così la morte delle cellule T mediata dal complemento nel sangue periferico e l'apoptosi nella milza e nei linfonodi (15). RATG ha anticorpi contro CD27, CD38, HLA-DR e ha dimostrato proprietà di cellule B anti-memoria in vitro e in vivo (15-17). La combinazione di rATG e rituximab ha ridotto le cellule B CD27 positive dalla milza nei pazienti in uno studio di desensibilizzazione che altrimenti non ha avuto successo è stata un'osservazione significativa (16).

Rituximab, un anticorpo monoclonale anti-CD20, ha una forte attività contro le cellule B e depleta le cellule B in circolo per 5-7 mesi. Ma quando le cellule B si differenziano in plasmacellule, il marcatore di superficie CD20 è sottoregolato, con concomitante perdita di sensibilità al rituximab (18). Rituximab è stato utilizzato in una varietà di malattie autoimmuni (19,20). Molti anticorpi non sono interessati mentre altri sono diminuiti per un periodo di tempo. Le plasmacellule a vita breve possono essere ridotte poiché non c'è una scorta pronta di cellule B per sostituirle dopo la loro breve emivita di tre giorni. In uno studio sul lupus eritematoso sistemico (LES) con rituximab; gli studi di citometria a flusso e di specificità degli autoanticorpi hanno rivelato che gli anticorpi contro Ro52 e La44 e il morbillo non erano diminuiti, ma gli anticorpi contro dsDNA e C1q erano diminuiti (19). La quantità complessiva di immunoglobuline non è cambiata. Le plasmacellule non sono influenzate dall'anti-CD20, quindi la produzione di anticorpi dalle plasmacellule a lunga vita continua senza sosta. I linfociti B della memoria sono CD 27+ e hanno un'espressione variabile di CD20. Uno studio sulla desensibilizzazione dei candidati al trapianto di rene ha dimostrato che il rituximab non ha ridotto il numero di cellule B di memoria CD27+ o plasmacellule nella milza (16). Nei pazienti (LES) trattati con rituximab, le cellule che ritornavano dopo la deplezione erano in gran parte cellule B naïve e i plasmablasti erano 2,3 volte superiori rispetto al basale (19). Mentre le cellule B della memoria circolanti nel sangue erano più basse dopo la terapia con rituximab, le cellule B della memoria nella milza sembrano non essere interessate e possono quindi trasformarsi in plasmablasti che possono quindi secernere anticorpi solubili. Questa osservazione spiega perché alcuni anticorpi scompariranno, almeno temporaneamente con rituximab mentre altri no. Se l'anticorpo proviene principalmente da plasmacellule o plasmablasti a vita breve, è più probabile che rituximab abbia un effetto; questi anticorpi sono prodotti da cellule con una breve emivita e dipendono dalla continua proliferazione delle cellule B. Gli anticorpi prodotti dalle plasmacellule a vita lunga non sono influenzati dal rituximab. Rituximab non influenza le cellule B della memoria nella milza, quindi possono riformare rapidamente plasmablasti e plasmacellule per ricostituire le linee cellulari producendo alcuni cloni di anticorpi. Poiché le cellule B della memoria possono diventare plasmacellule che secernono anticorpi, è vantaggioso rimuoverle prima del trapianto nel paziente altamente sensibilizzato.

È stato dimostrato che la combinazione di rATG e rituximab nell'uomo riduce le cellule B della memoria nella milza (16). Questa scoperta non è stata ancora incorporata in un protocollo di desensibilizzazione o in un protocollo per terapie autoimmuni dalla nostra revisione della letteratura. Nessun'altra terapia riduce efficacemente le cellule B della memoria nell'essere umano e rappresenta un nuovo aspetto di IND 110875.

Nessun agente utilizzato in precedenza nei trapianti, inclusi rATG e rituximab, ha la capacità di inibire le plasmacellule mature una volta che trovano rifugio nel midollo osseo e quindi ha scarso effetto sulla riduzione della produzione di anticorpi. Tuttavia, il bortezomib, un inibitore del proteasoma utilizzato nel trattamento del mieloma multiplo, ha la capacità di esaurire le plasmacellule attraverso molti meccanismi.

L'inibizione del proteasoma rappresenta una nuova strategia di trattamento perché fornisce un mezzo per l'esaurimento delle plasmacellule all'interno del midollo osseo (21,22). Bortezomib è approvato per l'uso nel trattamento del mieloma multiplo e la sensibilità delle cellule del mieloma agli inibitori del proteasoma è proporzionale ai loro tassi di sintesi delle immunoglobuline (22). È noto che le plasmacellule hanno alti tassi di sintesi delle immunoglobuline e il trattamento con bortezomib ha impoverito le plasmacellule sia a breve che a lunga vita di oltre il 60% nella milza e il 95% nel midollo osseo dopo 48 ore di trattamento nel modello murino BALB/c . Bortezomib ha attivato la risposta proteica dispiegata (UPR) documentata dall'aumento dell'espressione degli accompagnatori BiP e Chop che sono marcatori per UPR. Gli autori hanno anche concluso che anche l'inibizione tardiva del fattore di trascrizione anti-apoptotico NF-κB ha contribuito alla morte cellulare. In un modello di topo con nefrite da lupus (topi NZB/W F1) trattato con bortezomib, gli anticorpi specifici per dsDNA sono diminuiti fino al range di topi non autoimmuni. Le concentrazioni sieriche totali di IgG, IgG2a, IgG3, IgM e IgA erano tutte fortemente ridotte, ma le concentrazioni di IgG1 e IgG2 non erano alterate o erano solo leggermente alterate (21). Le concentrazioni totali di IgG non sono state ridotte di oltre il 50%. Gli autori hanno notato che le plasmacellule di nuova formazione potrebbero ritornare entro 48 ore dall'iniezione di bortezomib. Questi risultati supportano la conclusione che il bortezomib può uccidere le plasmacellule e avere un salutare effetto clinico, ma le cellule B della memoria non sono esaurite e le plasmacellule possono riprendersi rapidamente e produrre anticorpi indesiderati. La capacità del bortezomib di uccidere le plasmacellule non maligne rappresenta una scoperta importante con potenziale efficacia terapeutica nei trapianti e nelle malattie autoimmuni, ma di per sé non è in grado di ridurre a lungo termine gli anticorpi. Il riscontro clinico di riduzioni variabili dei livelli di anticorpi con bortezomib può essere spiegato da questi risultati nella letteratura scientifica di base.

Bortezomib è stato utilizzato come strategia di salvataggio per il trattamento del rigetto mediato da anticorpi refrattari (23-25). Uno studio in vitro ha rivelato che il bortezomib è stato in grado di indurre l'apoptosi nelle plasmacellule aspirate dai riceventi di trapianto renale, mentre rATG, rituximab e IVIG non sono riusciti a causare l'apoptosi (25). È stato dimostrato che il trattamento con bortezomib a concentrazioni che hanno bloccato la produzione di anticorpi in vitro riduce significativamente l'attività della peptidasi simile alla chimotripsina del proteasoma 20S. Due pazienti sono stati sottoposti a biopsie del midollo osseo durante il rigetto umorale acuto, una settimana dopo bortezomib e un anno dopo, che hanno rivelato che il numero totale di allospecificità delle plasmacellule è diminuito così come la percentuale totale di plasmacellule (25). Non tutti gli anticorpi sono stati ridotti dal bortezomib in questi due pazienti e i livelli totali di IgG sono rimasti invariati, tuttavia questo studio ha dimostrato che il bortezomib potrebbe ridurre le plasmacellule nel midollo osseo.

Bortezomib è indicato per il mieloma multiplo in cui le plasmacellule maligne sono molto aggressive nella produzione di anticorpi. Quanto più produttiva è la linea cellulare di mieloma nel produrre anticorpi, tanto più suscettibile all'inibizione del proteasoma (22). La letteratura di cui sopra nelle plasmacellule non maligne rivela anche che sono suscettibili all'inibizione del proteasoma con bortezomib, ma in una serie di studi, alcune frazioni di immunoglobuline non sono diminuite e le quantità complessive di immunoglobuline sono rimaste invariate. Forse le plasmacellule non sono metabolicamente attive come le loro controparti maligne. Ci sono alcune prove che le plasmacellule possono essere in grado di diminuire la loro sintesi di immunoglobuline e questo a sua volta le renderebbe meno suscettibili all'inibizione del proteasoma (26). Un riesame dell'omeostasi delle immunoglobuline rivela una potenziale terapia per aumentare la sensibilità al bortezomib.

Si ritiene in gran parte che l'omeostasi delle immunoglobuline sia il risultato della produzione di plasmacellule e quindi del riciclo mediato da FcRn nelle cellule endoteliali. L'anticorpo che non si combina con FcRn nell'endosoma della cellula endoteliale viene quindi degradato mentre l'anticorpo che si combina viene riciclato nello spazio interstiziale (27). Il concetto che le IgG non hanno un ciclo di feedback negativo verso la plasmacellula è supportato da dati nell'animale da esperimento e nell'uomo (28,29). Tuttavia, i medici osservano che i pazienti "rimbalzano" dopo la plasmaferesi con livelli di anticorpi che erano altrettanto alti o superiori rispetto a prima della plasmaferesi e questo ha portato alla conclusione che c'era un ciclo di feedback negativo (30,31). Il fenomeno del rimbalzo è stato spiegato come il ritorno dell'anticorpo dalla periferia e l'aumento del riciclo da parte dei recettori FcRn (28). La regolazione della sintesi proteica nella plasmacellula ha ricevuto nuova attenzione ed è controllata da un complesso sistema di circuiti di feedback che coinvolgono lo stress del reticolo endoplasmatico e la segnalazione mTOR (32).

Recenti indagini sul meccanismo della funzione delle immunoglobuline per via endovenosa, IVIG, offrono ulteriori informazioni sulla possibile spiegazione di un ciclo di feedback negativo alle plasmacellule. Si ritiene che l'IVIG nella letteratura clinica funzioni mediante una serie di percorsi tra cui anticorpi anti-idiotipici, inibizione dell'attivazione del gene delle citochine, attività del recettore anti-cellula T, attività anti CD4, stimolazione degli antagonisti del recettore delle citochine, inibizione dell'attività del complemento e mediata da Fc interazioni con le cellule presentanti l'antigene per bloccare l'attivazione delle cellule T (33). Il lavoro recente rivela che questi meccanismi sono probabilmente errati. Studi su bambini con ITP nel 1993 hanno rivelato che l'infusione di frammenti Fc forniva proprietà antinfiammatorie (34). Le proprietà antinfiammatorie delle IVIG possono ora essere attribuite alla sialilazione Fc delle IgG (35-37). Le immunoglobuline sono glicoproteine ​​e un singolo glicano N-linked si trova in Asn297 nel dominio Fc. Questo glicano complesso legato in modo covalente è composto da un eptapolisaccaride biantennario contenente N-acetilglucosamina e mannosio e due residui terminali di acido sialico (35). Ulteriori modifiche di questa struttura di carboidrati sono comuni e oltre 30 diversi glicani sono stati identificati in questo unico sito e la glicosilazione delle IgG è obbligatoria per il legame FcγR. L'attività antinfiammatoria totale di IVIG dipende dalla sialilazione dei frammenti IgG Fc e questa rappresenta solo il 5% del pool di IgG. La piccola quantità di IgG sialilate nelle IVIG spiega perché sono necessarie dosi elevate per i suoi effetti antinfiammatori mentre sono necessarie dosi molto più basse per trattare l'ipogammaglobulinemia. La plasmaferesi, diminuendo le IgG sialilate, può portare all'up-regulation della sintesi anticorpale nelle plasmacellule e renderle più suscettibili al bortezomib.

Il paziente indice trattato con un protocollo simile a questo, il paziente presentava una cancellazione effettiva (<5000MFI) di tutti i suoi anticorpi rilevati da LABScreen, inclusi gli anticorpi di classe II che prima erano stati difficili da rimuovere. Utilizzando i criteri molto più rigorosi di <1000 MFI, il paziente indice aveva un solo anticorpo rimanente superiore a 1000 alla fine dei 3 cicli della fase di trattamento con bortezomib. Il paziente era unico tra i case report di terapie per rigetto mediato da anticorpi e terapia di desensibilizzazione in quanto tutti gli anticorpi del paziente sono diminuiti drasticamente e la quantità totale di anticorpi solubili è diminuita al punto in cui il paziente ha richiesto IVIG per la terapia sostitutiva. Se questo risultato è riproducibile e il protocollo ha una sicurezza sufficiente, allora questi risultati potrebbero avere importanti ramificazioni nei campi del trapianto e delle malattie autoimmuni. Le malattie mediate da autoanticorpi possono ora avere il potenziale di cura se la memoria immunologica degli epitopi scatenanti viene cancellata.

È impossibile studiare questi farmaci nella solita metodologia un farmaco alla volta data la natura ridondante della memoria immunologica. Il potenziale rischio del protocollo è accettabile solo a causa della necessità di sviluppare una terapia efficace per una situazione pericolosa per la vita. Questo protocollo è in linea con i criteri chiariti dalla FDA nel recente articolo del New England Journal of Medicine, "Development of Novel Combination Therapies" (38). L'articolo descrive principalmente le terapie combinate per gli studi sul cancro; tuttavia, le componenti tematiche del documento si applicano a IND 110875.