Multi-Drug Desensibilization Protocol for hjertetransplantationskandidater

Transplantationskandidater med HLA-alloantistoffer har høj risiko for antistofmedieret afstødning (AMR), graftsvigt og akut afstødning (1,2). Ved hjertetransplantation fører disse komplikationer til døden. Den 50 % beregnede panelreaktive antistof, CPRA, tærskelværdi er valgt fra en konsensuserklæring fra International Society of Heart and Lung Transplantation (3). Denne værdi er ganske vist vilkårlig, men repræsenterer en konsensus om accepteret mening blandt erfarne og velrenommerede hjertetransplantationscentre.

De alloantistoffer, der forhindrer disse patienter i at blive transplanteret, er et resultat af det adaptive immunsystem og immunologisk hukommelse. Immunologisk hukommelse er defineret som immunsystemets evne til at give en hurtigere, stærkere og mere specifik respons på en anden eksponering af et antigen, når antigenet var fuldstændig elimineret fra organismen efter den forudgående eksponering.

Der er tre store cellelinjer involveret i immunologisk hukommelse: hukommelses-T-celler, hukommelses-B-celler og plasmaceller, som alle kan overleve, når antigenet er blevet elimineret (4). B-celler kan montere responser på både små opløselige antigener og store antigener (5). Når først en B-celle bliver aktiveret, kan den blive en kortvarig plasmacelle og producere immunglobulin M, (IgM), antistoffer, eller den kan komme ind i et germinal center, hvor den kan gennemgå somatisk hypermutation med affinitetsmodning og isotypeskift. B-cellen kan derefter differentiere til en langlivet plasmacelle og konkurrere om en knoglemarvsniche eller kan blive en hukommelses-B-celle (4-8).

Hukommelses-T-celler kan vare hele livet og kan recirkulere mellem de sekundære lymfoide organer (SLO) som centrale hukommelses-T-celler (TCM) eller i det perifere væv som effektorhukommelses-T-celler (TEM) (4,9). Når de møder deres beslægtede antigen, kan de hurtigt proliferere og differentiere til effektor-T-celler.

Hukommelse B-celler prolifererer langsomt og recirkulerer i SLO'erne, holder der i årtier, og hukommelses-B-celler til vaccinia (kopper) har vist sig at overleve i mere end 50 år (9). De er almindeligvis identificeret ved tilstedeværelsen af ​​CD27 og efter en anden antigen udfordring; hukommelses-B-cellerne kan hurtigt proliferere og derefter differentiere til nye plasmaceller (10). Dette fænomen tilvejebringer et redundant system eller "array" til at genopbygge plasmaceller, der producerer antistof for et givet antigen.

Plasmaceller er stærkt differentierede og specifikke celler, der aktivt kan producere alloantistof. Der er to populationer af plasmaceller, kortlivede og langlivede (8). Langlivede plasmaceller kan vare livet ud og kan dukke op inden for mindre end 1 uge efter antigen stimulering (6,7). I kernebiopsier af nyretransplanterede modtagere er B-celler, hukommelses-B-celler, plasmablaster og plasmaceller alle blevet identificeret under akutte afstødninger (11). Plasmacellerne er endedifferentierede og kan derfor ikke formere sig. I knoglemarven er der et begrænset antal overlevelsesnicher (109) afhængigt af antallet af stromaceller til stede for at understøtte dem. Plasmaceller, der ikke finder et fristed i marven eller mister et fristed, varer kun et par dage, sandsynligvis på grund af de intense metaboliske krav fra en celle, der kan producere mellem 10.000 og 20.000 kopier af antistof i sekundet (12). Plasmaceller menes i øjeblikket at være uden en negativ feedback-loop til at undertrykke deres antistofsyntese. Plasmaceller har vist sig at have en FcγRIIB-receptor koblet til et immunoreceptor-tyrosinbaseret hæmmende motiv (ITIM) (13). FcyRIIB-receptoren er en lavaffinitetsreceptor og kan ikke binde monomert immunoglobulin G, (IgG). Homøostasen af ​​immunoglobulin menes hovedsageligt at være endotelcellens ansvar (14). Når først et antistof er produceret, kan endotelceller eliminere cirkulerende antistof ved lysosomal nedbrydning eller recirkulering af antistoffet gennem en Fc-receptor neonatal, (FcRn) afhængig mekanisme tilbage i plasmaet.

En vellykket plan for at eliminere hukommelsen om et givet antigent møde skal adressere de tre separate systemer eller "arrays". Elimineringen af ​​immunologisk hukommelse, således at skadelige antistoffer kunne fjernes, og derpå dannede nye gunstige antistoffer, ville være et betydeligt fremskridt inden for områderne transplantation og autoimmunitet. En gennemgang af de medikamenter, der anvendes i IND 110875, vil belyse, hvorfor denne protokol kan være vellykket, hvor alle andre har fejlet.

Kanin-antithymocytglobulin, RATG, har anti-T-celle-egenskaber, og især aktivitet mod hukommelses-T-celle-overfladeantigener, og forårsager derved komplementmedieret T-celledød i perifert blod og apoptose i milten og lymfeknuderne (15). RATG har antistoffer mod CD27, CD38, HLA-DR og har vist anti-hukommelse B-celle egenskaber in vitro og in vivo (15-17). Kombinationen af ​​rATG og rituximab reducerede CD27 positive B-celler fra milten hos patienter i et desensibiliseringsforsøg, der ellers var mislykket, var en signifikant observation (16).

Rituximab, et anti-CD20 monoklonalt antistof, har stærk aktivitet mod B-celler og udtømmer B-celler i kredsløbet i 5-7 måneder. Men da B-celler differentieres til plasmaceller, nedreguleres CD20-overflademarkøren med samtidig tab af følsomhed over for rituximab (18). Rituximab er blevet brugt til en række autoimmune sygdomme (19,20). Mange antistoffer påvirkes ikke, mens andre er nedsat i en periode. Kortlivede plasmaceller kan være nedsat, da der ikke er en klar forsyning af B-celler til at erstatte dem efter deres korte tre-dages halveringstid. I en undersøgelse af systemisk lupus erythematosis (SLE) ved brug af rituximab; flowcytometri og autoantistofspecificitetsundersøgelser afslørede, at antistoffer mod Ro52 og La44 og mæslinger ikke var nedsat, men antistoffer mod dsDNA og C1q faldt (19). Den samlede mængde af immunoglobulin ændrede sig ikke. Plasmaceller påvirkes ikke af anti-CD20, så antistofproduktionen fra langlivede plasmaceller fortsætter uformindsket. Hukommelse B-celler er CD 27+ og har et variabelt udtryk for CD20. En undersøgelse af desensibiliserende nyretransplantationskandidater viste, at rituximab ikke reducerede antallet af CD27+-hukommelses-B-celler eller plasmaceller i milten (16). Hos (SLE) patienter behandlet med rituximab var cellerne, der vendte tilbage efter depletering, stort set naive B-celler, og plasmablasterne var 2,3 gange højere end ved baseline (19). Mens hukommelses-B-celler, der cirkulerer i blodet, var lavere efter rituximab-behandling, ser hukommelses-B-cellerne i milten ud til at være upåvirkede og kan derefter transformeres til plasmablaster, som derefter kan udskille opløseligt antistof. Denne observation forklarer, hvorfor nogle antistoffer vil forsvinde, i det mindste midlertidigt med rituximab, mens andre ikke vil. Hvis antistoffet primært kommer fra kortlivede plasmaceller eller plasmablaster, vil rituximab mere sandsynligt have en effekt; disse antistoffer produceres af celler med en kort halveringstid og er afhængige af kontinuerlig proliferation af B-celler. Antistoffer produceret af langlivede plasmaceller påvirkes ikke af rituximab. Rituximab påvirker ikke hukommelse B-celler i milten, så de kan hurtigt reformere plasmablaster og plasmaceller for at rekonstituere de cellelinjer, der producerer visse kloner af antistoffer. Da hukommelses-B-celler kan blive til antistofudskillende plasmaceller, er det fordelagtigt at fjerne dem før transplantation i den stærkt sensibiliserede patient.

Kombinationen af ​​rATG og rituximab viste sig hos mennesker at reducere hukommelse B-celler i milten (16). Dette fund er endnu ikke blevet inkorporeret i en desensibiliseringsprotokol eller i en protokol for autoimmune terapier fra vores gennemgang af litteraturen. Ingen anden terapi reducerer effektivt hukommelses B-celler hos mennesker, og den repræsenterer et nyt aspekt af IND 110875.

Ingen midler, der tidligere er brugt til transplantation, inklusive rATG og rituximab, har evnen til at hæmme modne plasmaceller, når de først finder tilflugt i knoglemarven, og har derfor ringe effekt på at reducere antistofproduktionen. Bortezomib, en proteasomhæmmer, der anvendes til behandling af myelomatose, har imidlertid evnen til at udtømme plasmaceller via mange mekanismer.

Proteasomhæmning repræsenterer en ny behandlingsstrategi, fordi den giver et middel til at udtømme plasmaceller i knoglemarven (21,22). Bortezomib er godkendt til brug i behandling af myelomatose, og myelomcellernes følsomhed over for proteasomhæmmere er proportional med deres immunoglobulinsyntesehastigheder (22). Plasmaceller er kendt for at have høje immunoglobulinsyntesehastigheder, og behandling med bortezomib udtømte både kort- og langlivede plasmaceller med mere end 60 % i milten og 95 % i knoglemarven efter 48 timers behandling i BALB/c-musemodellen . Bortezomib aktiverede det udfoldede proteinrespons (UPR) dokumenteret ved stigninger i ekspressionen af ​​chaperonerne BiP og Chop, som er markører for UPR. Forfatterne konkluderede også, at den sene hæmning af den anti-apoptotiske transkriptionsfaktor NF-KB også bidrog til celledød. I en lupus nefritis-musemodel (NZB/W F1-mus) behandlet med bortezomib, faldt dsDNA-specifikke antistoffer til området for ikke-autoimmune mus. Totale serum-IgG-, IgG2a-, IgG3-, IgM- og IgA-koncentrationer blev alle stærkt reduceret, men koncentrationerne af IgG1 og IgG2 blev ikke ændret eller kun lidt ændret (21). Totale IgG-koncentrationer blev ikke reduceret med mere end 50%. Forfatterne bemærkede, at nydannede plasmaceller kunne vende tilbage 48 timer efter bortezomib-injektion. Disse fund understøtter konklusionen om, at bortezomib kan dræbe plasmaceller og have en gavnlig klinisk effekt, men hukommelse B-celler er ikke udtømte, og plasmaceller kan hurtigt komme sig og producere uønsket antistof. Bortezomibs evne til at dræbe ikke-maligne plasmaceller repræsenterer et væsentligt fund med potentiel terapeutisk effekt ved transplantation og autoimmune sygdomme, men er i sig selv ude af stand til langvarige reduktioner af antistof. De kliniske fund af variable reduktioner i antistofniveauer med bortezomib kan forklares ud fra disse fund i den grundlæggende videnskabelige litteratur.

Bortezomib er blevet brugt som en redningsstrategi til behandling af refraktær antistofmedieret afstødning (23-25). Et in vitro-studie afslørede, at bortezomib var i stand til at inducere apoptose i plasmaceller, der blev aspireret fra nyretransplanterede modtagere, hvorimod rATG, rituximab og IVIG alle ikke forårsagede apoptose (25). Behandling med bortezomib i koncentrationer, der blokerede antistofproduktion in vitro, viste sig at reducere den 20S-proteasom-chymotrypsinlignende peptidaseaktivitet signifikant. To patienter fik knoglemarvsbiopsier under akut humoral afstødning, en uge efter bortezomib og et år senere, hvilket afslørede, at det samlede antal plasmacelle-allospecificiteter faldt ligesom den samlede procentdel af plasmaceller (25). Ikke alle antistoffer blev reduceret af bortezomib hos disse to patienter, og de samlede IgG-niveauer var uændrede, men denne undersøgelse viste, at bortezomib kunne reducere plasmaceller i knoglemarven.

Bortezomib er indiceret til myelomatose, hvor de ondartede plasmaceller er meget aggressive til at producere antistof. Jo mere produktiv myelomcellelinjen er til at lave antistof, jo mere modtagelig for proteasomhæmning (22). Ovenstående litteratur om ikke-maligne plasmaceller afslører også, at de er modtagelige for proteasomhæmning med bortezomib, men i en række undersøgelser faldt visse immunoglobulinfraktioner ikke, og de samlede mængder af immunglobulin var uændrede. Måske er plasmaceller ikke så metabolisk aktive som deres ondartede modstykker. Der er nogle beviser for, at plasmaceller kan være i stand til at nedsætte deres immunoglobulinsyntese, og dette vil igen gøre dem mindre modtagelige for proteasomal hæmning (26). En genundersøgelse af immunoglobulin-homeostase afslører en potentiel behandling til at øge følsomheden over for bortezomib.

Immunoglobulin-homeostase menes stort set at være resultatet af plasmacelleproduktion og derefter FcRn-medieret genanvendelse i endotelcellerne. Antistof, der ikke kombinerer med FcRn i endosomet af endotelcellen, nedbrydes derefter, mens antistof, der kombineres, recirkuleres tilbage til det interstitielle rum (27). Konceptet om, at IgG ikke har en negativ feedback-loop til plasmacellen, understøttes af data fra forsøgsdyret og mennesker (28,29). Klinikere observerer dog, at patienter "rebounder" efter plasmaferese med niveauer af antistof, der var lige så høje eller højere end før plasmaferese, og dette førte til den konklusion, at der var en negativ feedback-loop (30,31). Rebound-fænomenet blev bortforklaret som tilbagevenden af ​​antistof fra periferien og øget genanvendelse af FcRn-receptorer (28). Reguleringen af ​​proteinsyntesen i plasmacellen har fået ny opmærksomhed og styres af et komplekst system af feedback-loops, der involverer endoplasmatisk retikulumstress og mTOR-signalering (32).

Nylige undersøgelser af mekanismen for intravenøs immunoglobulin, IVIG, funktion giver yderligere indsigt i mulig forklaring på en negativ feedback-loop til plasmaceller. IVIG i den kliniske litteratur menes at virke via en række veje, herunder anti-idiotypiske antistoffer, hæmning af cytokin-genaktivering, anti-T-celle-receptoraktivitet, anti-CD4-aktivitet, stimulering af cytokinreceptorantagonister, hæmning af komplementaktivitet og Fc-medieret interaktioner med antigenpræsenterende celler for at blokere T-celleaktivering (33). Nyere arbejde afslører, at disse mekanismer muligvis er fejlagtige. Undersøgelser af børn med ITP i 1993 viste, at infusion af Fc-fragmenter gav de antiinflammatoriske egenskaber (34). De antiinflammatoriske egenskaber ved IVIG kan nu tilskrives Fc-sialylering af IgG (35-37). Immunoglobuliner er glycoproteiner, og en enkelt N-bundet glycan findes ved Asn297 i Fc-domænet. Denne kovalent forbundne komplekse glycan er sammensat af et biantennært heptapolysaccharid indeholdende N-acetylglucosamin og mannose og to terminale sialinsyrerester (35). Yderligere modifikationer af denne kulhydratstruktur er almindelige, og over 30 forskellige glycaner er blevet identificeret på dette ene sted, og glycosylering af IgG er obligatorisk for FcγR-binding. Den totale antiinflammatoriske aktivitet af IVIG afhænger af sialyleringen af ​​IgG Fc-fragmenterne, og dette repræsenterer kun 5% af IgG-puljen. Den lille mængde sialyleret IgG i IVIG forklarer, hvorfor store doser er nødvendige for dets antiinflammatoriske virkninger, mens meget lavere doser er nødvendige for at behandle hypogammaglobulinemi. Plasmaferese kan ved at reducere sialyleret IgG føre til opregulering af antistofsyntese i plasmaceller og gøre dem mere modtagelige for bortezomib.

Indekspatienten behandlet med en protokol svarende til denne, patienten havde effektiv sletning (< 5000MFI) af alle deres antistoffer påvist af LABScreen, inklusive klasse II-antistoffer, som før dette havde været svære at fjerne. Ved at bruge de meget strengere kriterier på < 1000 MFI havde indekspatienten kun ét resterende antistof over 1000 ved afslutningen af ​​3 cyklusser af bortezomib-behandlingsfasen. Patienten var unik blandt case-rapporterne om terapier til antistofmedieret afstødnings- og desensibiliseringsterapi, idet alle patientens antistoffer faldt dramatisk, og den samlede mængde opløseligt antistof faldt til det punkt, hvor patienten havde brug for IVIG til erstatningsterapi. Hvis dette resultat er reproducerbart, og protokollen har tilstrækkelig sikkerhed, kan disse resultater have vigtige konsekvenser inden for transplantation og autoimmun sygdom. Autoantistofmedierede sygdomme kan nu have potentialet til helbredelse, hvis den immunologiske hukommelse af de inciterende epitoper slettes.

Det er umuligt at studere disse medikamenter i den sædvanlige et-lægemiddel-ad-gangen-metode i betragtning af den overflødige karakter af immunologisk hukommelse. Den potentielle risiko ved protokollen er kun acceptabel på grund af behovet for at udvikle en effektiv terapi til en livstruende situation. Denne protokol er i overensstemmelse med de kriterier, der er belyst af FDA i den nylige artikel i New England Journal of Medicine, "Development of Novel Combination Therapies" (38). Artiklen beskriver hovedsageligt kombinationsterapier til kræftforsøg; de tematiske komponenter i dokumentet gælder dog for IND 110875.