Studium přítomnosti a funkce erytropoetinového receptoru ve vzorcích lidské rakoviny (EPO-CAN)

Pozadí: Erytropoetin, EPO, je hlavním regulátorem a stimulátorem erytropoézy kostní dřeně a je zodpovědný za růst a diferenciaci erytroidní buněčné linie. Klonování genu vedlo k produkci rekombinantního produktu, rHuEPO. rHuEPO v posledních několika desetiletích úspěšně sloužil jak pro výzkum, tak pro klinické aplikace. Bylo prokázáno, že přípravek zlepšuje anémii konečného stádia onemocnění ledvin, anémie související s rakovinou, stejně jako jiné typy anémie a/nebo ztráty krve. Zlepšená anémie způsobená rHuEPO je charakterizována zvýšenými hladinami hemoglobinu (Hb) a hematokritu (Hct), sníženými potřebami krevních transfuzí a zlepšenou kvalitou života. Použití rHuEPO se tak stalo rutinní každodenní praxí v hematologii a onkologii, přičemž miliony pacientů s rakovinou s anémií nebo bez ní byly léčeny rHuEPO. Ve skutečnosti se rHuEPO stal trhákem (přes roční tržby za miliardu dolarů) a nejběžnějším biologickým produktem na trhu.

V roce 2003 zprávy naznačovaly, že pacienti s rakovinou prsu a rakovinou hlavy a krku léčeni rHuEPO měli kratší přežití než pacienti, kteří nebyli tímto hormonem léčeni. Po těchto zprávách následovalo několik dalších. Jiné zprávy, včetně naší, však vedly k jiným závěrům. Metaanalýza také nedokázala poskytnout definitivní odpověď.

Pro vysvětlení potenciální špatné prognózy u pacientů s rakovinou léčených rHuEPO byly navrženy tři potenciální mechanismy, z nichž žádný nebyl dosud prokázán:

1. Stimulace receptorů EPO (EPO-R), existujících na povrchu nádorových buněk.
2. Vysoká hladina Hb a Hct, což vede k viskozitě a trombotickým komplikacím.
3. Zvýšená angiogeneze indukovaná rHuEPO podporujícím progresi nádoru. Jak se očekávalo, tyto protichůdné zprávy vyvolaly kontroverzi mezi klinickými hematologicko-onkologickými komunitami, omezily používání přípravku a vedly Poradní výbor pro onkologická léčiva FDA (ODAC) ke zveřejnění výstrahy. Americká společnost klinické onkologie (ASCO) a Americká hematologická společnost (ASH), stejně jako Evropská organizace pro výzkum a léčbu rakoviny (EORTC), zveřejnily přísné pokyny, které definují, kdo jsou pacienti a za jakých okolností by měl rHuEPO být nebo neměl by být podáván.

S naším dlouholetým spolupracovníkem prof. D. Neumannem, Sacklerova lékařská fakulta, TAU, jsme založili evropské mezinárodní konsorcium se špičkovými základními vědci a klinickými výzkumníky s obecným cílem téma dále studovat. Nedávno bylo konsorcium vedené prof. Neumannem oznámeno, že EU uznala důležitost projektu a rozhodla se jej financovat prestižním výzkumným grantem 7. RP.

Náš tým ve spolupráci s partnery (viz níže) převzal odpovědnost za studium přítomnosti, funkce a klinického významu EPO-R ve vzorcích lidské rakoviny.

Obecný cíl navrhovaného projektu: Studovat EPO-R ve vzorcích lidské rakoviny.

Konkrétní cíle:

Detekce EPO-R na nádorových buňkách Testování funkce EPO-R Sledovat pacienty a studovat možnou korelaci mezi přítomností a funkcí EPO-R ve vzorcích nádoru a klinickým výsledkem a prognózou.

Metody:

Retrospektivní projekt:

(Zřeknutí se informovaného souhlasu bude požadováno od ledna 1990 do prosince 2011)

• Jako podklad pro danou část práce poslouží připravené preparáty z již odebraných preparátů (vzorků).
• V případě potřeby budou připraveny další preparáty z patologického „bloku“.

• Požadované vzorky:

  1. Rakovina prsu - 50 (od 50 pacientů)
  2. Rakovina tlustého střeva - 50
  3. Rakovina plic - 50
  4. Rakovina hlavy a krku - 50
  5. Biopsie lymfatických uzlin (pozitivní na lymfom) - 50 Pro studii nebudou použity vzorky rakovinných tkání z bronchoskopie, endoskopie a FNA/FNB, kde je pouze malé množství tkáně.
• Neobarvená, neidentifikovaná sklíčka budou přenesena do laboratoře prof. Drorita Neumanna na Sacklerově lékařské fakultě, kde bude provedena analýza sklíček na obsah EPO-R. Část těchto diapozitivů bude přenesena na Queens University, Belfast, Irsko a stejné testy budou provedeny v laboratoři prof. Makswell.
• Sklíčka budou obarvena anti-EPO-R protilátkami (Abs). Tyto Abs budou generovány jako součást evropského projektu EPO-CAN Dr. Johnem Thompsonem a jeho týmem v Aldevron, Freiburg, Německo.
• Aby se připravil formalínem fixovaný parafínový vosk zalitý (FFPE) materiál, vzorky tkáně se fixují v 10% pufrovaném formalínu přes noc při teplotě místnosti a zpracují se přes tříděné alkoholy na parafinový vosk. Po zalití se na aktivovaná sklíčka nařežou 3-5 um řezy a umístí přes noc do inkubátoru při 37 °C. Ty jsou připraveny pro imunohistochemii. Toto je naše standardní metodika pro jednotlivé sekce. Pro tkáňové mikročipy (TMAs) jsou vybrané případy identifikovány a oblasti zájmu označeny pomocí hematoxylinem a eosinem barvených sklíček. Regiony jsou vyjmuty ze svých původních bloků a znovu vloženy podle vytvořené mapy. V jednom bloku je umístěno 50 až 100 jader. Z nich se nařežou sériové 3-5 um řezy a zpracují se jako výše. Screening a optimalizace parametrů barvení protilátek se provádí na preparátech s jednou sekcí. Vybrané protilátky vhodné pro materiál FFPE se používají k barvení TMA normálních a maligních tkání z řady nádorů, připravené v Northern Ireland Biobank.

Poznámka: Sběr informací ze vzorků bude prováděn anonymní technikou a bude nevratným způsobem oddělen od identifikačních údajů pacienta.

Budoucí projekt:

(Je vyžadován informovaný souhlas pacienta)

• Podobná práce bude provedena, ale na čerstvých vzorcích materiálu, které budou odebrány z biopsií na operačním sále.
• Pacienti budou identifikováni s 2-3letým sledováním klinického průběhu a pokusem o korelaci průběhu a klinického výsledku s přítomností a funkcí EPO-R na nádorových buňkách.

Poznámka:

Bude zapotřebí pouze malý (malý) kousek tkáně pacienta. Neměl by tedy interferovat s žádnou jinou aktivitou nebo testem požadovaným pro rozhodovací proces pacienta. Ve skladu zůstane dostatek tkáně pacienta pro budoucí lékařské testy pro terapeutické cíle.