Badanie obecności i funkcji receptora erytropoetyny w ludzkich próbkach raka (EPO-CAN)

Wstęp: Erytropoetyna, EPO, jest głównym regulatorem i stymulatorem erytropoezy szpiku kostnego oraz odpowiada za wzrost i różnicowanie linii komórek erytroidalnych. Klonowanie genu doprowadziło do wytworzenia rekombinowanego produktu, rHuEPO. rHuEPO z powodzeniem służył przez ostatnie kilka dekad zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i klinicznych. Wykazano, że produkt poprawia anemię w schyłkowej niewydolności nerek, anemię związaną z rakiem, a także inne rodzaje anemii i/lub utratę krwi. Poprawa anemii dzięki rHuEPO charakteryzuje się zwiększonym poziomem hemoglobiny (Hb) i hematokrytu (Hct), zmniejszonym zapotrzebowaniem na transfuzję krwi i poprawą jakości życia. W ten sposób stosowanie rHuEPO stało się rutynową codzienną praktyką w hematologii i onkologii, a miliony pacjentów z rakiem z niedokrwistością lub bez niej leczono rHuEPO. Rzeczywiście, rHuEPO stało się przebojem (ponad roczna sprzedaż w wysokości miliarda dolarów) i najpopularniejszym produktem biologicznym na rynku.

W 2003 roku raporty sugerowały, że pacjenci z rakiem piersi i rakiem głowy i szyi leczeni rHuEPO mieli krótsze przeżycie niż pacjenci, którzy nie byli leczeni tym hormonem. Po tych doniesieniach pojawiło się kilka innych. Jednak inne raporty, w tym nasz, prowadziły do ​​innych wniosków. Metaanaliza również nie dała ostatecznej odpowiedzi.

Zaproponowano trzy potencjalne mechanizmy, z których żaden jak dotąd nie został udowodniony, aby wyjaśnić potencjalne złe rokowanie wśród pacjentów z rakiem leczonych rHuEPO:

1. Stymulacja receptorów EPO (EPO-R), występujących na powierzchni komórek nowotworowych.
2. Wysoki poziom Hb i Hct, prowadzący do lepkości i powikłań zakrzepowych.
3. Zwiększona angiogeneza indukowana przez rHuEPO promująca progresję nowotworu. Zgodnie z oczekiwaniami, te sprzeczne doniesienia wywołały kontrowersje wśród klinicznych społeczności hematologiczno-onkologicznych, ograniczyły stosowanie produktu i skłoniły Komitet Doradczy ds. Leków Onkologicznych FDA (ODAC) do opublikowania ostrzeżenia. Amerykańskie Towarzystwo Onkologii Klinicznej (ASCO) i Amerykańskie Towarzystwo Hematologii (ASH), a także Europejska Organizacja Badań i Leczenia Raka (EORTC) opublikowały ścisłe wytyczne określające, kim są pacjenci i w jakich okolicznościach rHuEPO powinno być lub nie być podawanym.

Wraz z naszym długoletnim współpracownikiem, prof. D. Neumannem z Wydziału Lekarskiego Sackler, TAU, utworzyliśmy europejskie międzynarodowe konsorcjum z czołowymi naukowcami i badaczami klinicznymi, którego ogólnym celem jest dalsze badanie tematu. Niedawno konsorcjum kierowane przez prof. Neumanna otrzymało informację, że UE uznała znaczenie projektu i postanowiła sfinansować go z prestiżowego grantu badawczego 7PR.

Nasz zespół we współpracy z partnerami (patrz poniżej) podjął się zbadania obecności, funkcji i znaczenia klinicznego EPO-R w ludzkich próbkach raka.

Ogólny cel proponowanego projektu: Badanie EPO-R w ludzkich próbkach raka.

Cele szczegółowe:

Wykrywanie EPO-R na komórkach nowotworowych Testowanie funkcji EPO-R Obserwacja pacjentów i badanie możliwej korelacji między obecnością i funkcją EPO-R w próbkach guza a wynikami klinicznymi i rokowaniem.

Metody:

Projekt retrospektywny:

(Rezygnacja ze świadomej zgody będzie wymagana od stycznia 1990 do grudnia 2011)

• Podstawą tej części pracy będą przygotowane slajdy z wykonanych już preparatów (próbek).
• W razie potrzeby zostaną przygotowane dodatkowe preparaty z „bloku” patologicznego.

• Wymagane próbki:

  1. Rak piersi - 50 (od 50 pacjentów)
  2. Rak jelita grubego - 50
  3. Rak płuc - 50
  4. Rak głowy i szyi - 50
  5. Biopsja węzłów chłonnych (dodatnia w kierunku chłoniaka) - 50 Próbki tkanek nowotworowych z bronchoskopii, endoskopii i BACC, gdzie jest tylko niewielka ilość tkanki, nie będą wykorzystywane do badań.
• Niewybarwione, niezidentyfikowane preparaty zostaną przekazane do laboratorium prof. Drorita Neumanna na Wydziale Lekarskim Sacklera, gdzie zostanie przeprowadzona analiza preparatów pod kątem zawartości EPO-R. Część tych szkiełek zostanie przeniesiona do Queens University w Belfaście w Irlandii i te same testy zostaną przeprowadzone w laboratorium prof. Makswella.
• Szkiełka zostaną wybarwione przeciwciałami anty-EPO-R (Abs). Abs te zostaną wygenerowane w ramach europejskiego projektu EPO-CAN przez dr Johna Thompsona i jego zespół w Aldevron we Freiburgu w Niemczech.
• W celu przygotowania utrwalonego w formalinie materiału zatopionego w wosku parafinowym (FFPE), próbki tkanek utrwala się w 10% buforowanej formalinie przez noc w temperaturze pokojowej i poddaje obróbce za pomocą stopniowanych alkoholi do wosku parafinowego. Po zatopieniu skrawki 3-5 µm wycina się na aktywowanych szkiełkach i umieszcza w inkubatorze w temperaturze 37°C na noc. Są gotowe do immunohistochemii. To jest nasza standardowa metodologia dla pojedynczych sekcji. W przypadku mikromacierzy tkankowych (TMA) identyfikuje się wybrane przypadki i zaznacza obszary zainteresowania za pomocą preparatów barwionych hematoksyliną i eozyną. Regiony są tworzone z ich oryginalnych bloków i ponownie osadzone zgodnie z ustaloną mapą. Na blok przypada od 50 do 100 rdzeni. Wycina się z nich seryjne skrawki o grubości 3-5 µm i traktuje jak powyżej. Optymalizację parametrów skriningu i barwienia przeciwciał przeprowadza się na preparatach pojedynczych skrawków. Wyselekcjonowane przeciwciała odpowiednie dla materiału FFPE są używane do barwienia TMA tkanek prawidłowych i złośliwych z szeregu nowotworów, przygotowanych w Biobanku Irlandii Północnej.

Uwaga: Zbieranie informacji z próbek zostanie przeprowadzone techniką anonimową i zostanie w sposób nieodwracalny odseparowane od danych identyfikacyjnych pacjenta.

Przyszły projekt:

(Wymagana jest świadoma zgoda pacjenta)

• Podobna praca zostanie wykonana, ale na świeżych próbkach materiału, które zostaną pobrane z biopsji na sali operacyjnej.
• Pacjenci zostaną zidentyfikowani, z 2-3-letnią obserwacją przebiegu klinicznego i próbą skorelowania przebiegu i wyniku klinicznego z obecnością i funkcją EPO-R na komórkach nowotworowych.

Notatka:

Wymagany będzie tylko mały (mały) kawałek tkanki pacjenta. Dlatego nie powinno to kolidować z żadną inną czynnością ani badaniem wymaganym do podejmowania decyzji przez pacjenta. W przechowywaniu pozostanie wystarczająca ilość tkanki pacjenta do przyszłych testów medycznych do celów terapeutycznych.