Terapie kmenovými buňkami pro léčbu ženské stresové močové inkontinence

** Nastavení studie: Studie se bude konat v porodnici Univerzitní porodnice Ain-Shams – urogynekolická jednotka; nábor pacientů z urogynekologické ambulance

** Velikost vzorku:

Padesát pacientek se stresovou inkontinencí moči v důsledku nedostatku vnitřního svěrače bude rozděleno do dvou skupin; skupině A zahrnující 25 pacientů budou injekčně podány kmenové buňky a budou to pacienti odmítající operaci jako primární linii léčby nebo nevhodní k operaci. skupina B; včetně 25 pacientek podstoupí operaci vaginální pásky bez napětí. Velikost vzorku se určí podle následující rovnice:

[P1(100-P1) + P2(100-P2)] / (P2 - P1)2 kde; Síla testu = 80 % Úroveň spolehlivosti = 95 % Chyba alfa = 5 % Za předpokladu úspěšnosti přednostně používané intervence „beznapěťová vaginální páska“ u pacientek s vnitřním deficitem svěrače P1=80 % (Schierlitz et al, 2008).

Za předpokladu úspěšnosti terapie kmenovými buňkami P2= 90 % (Smaldone et al, 2009).

** Zásah:

1. Souhlas Informovaný souhlas bude přijat v souladu s Helsinskou deklarací Světové lékařské asociace (WMA); etické principy lékařského výzkumu zahrnujícího lidské subjekty.
2. Anamnéza Od každého pacienta bude odebrána úplná anamnéza spolu s podrobnou anamnézou týkající se návyků při močení, inkontinence, dysfunkce močení, infekce močových cest. Bude získán dotazník o inkontinenci a dotazník o kvalitě života.
3. Vyšetření Kompletní fyzikální a pánevní vyšetření ke zhodnocení přítomnosti stresové močové inkontinence a k vyloučení pacientů s výraznou hypermobilitou uretry nebo těžkou cystokélou či rektokélou.
4. Urodynamická studie Bude provedena vícekanálová urodynamická studie s použitím Euet Sensik ® včetně cystometrie, měření uretrálního tlaku, měření abdominálního tlaku v bodě úniku (ALPP) a měření zbytkové moči. Budou vybráni pacienti se stresovou inkontinencí moči v důsledku nedostatku vnitřního svěrače. Kritéria pro výběr jsou: absence nedobrovolných kontrakcí během úniku způsobeného stresovým manévrem; nízká ALPP (<60 cmH20); & maximální uzavírací tlak uretry (MUCP) <20-30 cmH2O. Pacienti s mikční dysfunkcí budou vyloučeni (zbytkový objem moči >100 ml).

5. Získávání, kultivace a zpracování buněk:

   * Aspirace kostní dřeně:

   - Místo: zadní horní hřeben kyčelní.

   -Postup: Pacient je uložen do laterální dekubitální polohy, horní noha je flektovaná a bérce rovná. Hřeben kyčelní kosti je prohmatán a preferované místo odběru je označeno perem. Používá se aseptická technika, včetně sterilních rukavic a pláště. Místo je připraveno antiseptikem (povidon-jod), vydrhnuto a překryto, přičemž se obnaží pouze místo, z něhož má být odebrán vzorek. Kůže a tkáň ležící pod periostem jsou infiltrovány lokálním anestetikem (přibližně 10 ml 1% xylokainu [lidokainu]). Injekční stříkačka o objemu 10 ml s jehlou velikosti 25 se používá k injekci počátečních 0,5 ml přímo pod kůži, čímž dojde ke zvednutí pupínků. Jehla 22 gauge se používá k proniknutí hlouběji do podkožní tkáně a spodního periostu, do oblasti o průměru zhruba 1 cm. Kožní řez se provede malou chirurgickou čepelí, kterou se zavede jehla pro aspiraci kostní dřeně se styletem zajištěným na místě. Jakmile se jehla dotkne kosti, postupuje se pomalým otáčením ve směru a proti směru hodinových ručiček, dokud kortikální kost nepronikne a nevstoupí do dřeňové dutiny. Hloubka penetrace by neměla přesahovat počáteční 1 cm. Jakmile se sonda dostane do dřeňové dutiny, odstraní se. Pomocí 20ml injekční stříkačky se odsaje přibližně 5 ml kostní dřeně. Následující vzorky se získají připojením samostatné injekční stříkačky, přičemž se odebírá 5 ml najednou. Vzorky se poté přenesou do zkumavky obsahující kyselinu ethylendiamintetraoctovou (EDTA). Jehla dřeně se odstraní a na místo aspirace se aplikuje tlak pomocí gázy, dokud se krvácení nezastaví.

   * Zpracování a kultivace buněk:

   - Mononukleární buňky (MNC) budou izolovány centrifugací v hustotním gradientu pomocí Ficol/Hypaque.

   - Mezenchymální kmenové buňky (MSC) budou izolovány pomocí plastické adherence naočkováním MNC do lahví pro tkáňové kultury T25 v kompletním kultivačním médiu (DMEM, 1 % antibiotika/antimykotikum, 20 % autologní sérum). Baňky budou inkubovány při 37ºC v CO2 inkubátoru po dobu 3-5 dnů.

   - Po 5 dnech se v baňkách pod inverzním mikroskopem vyhodnotí počet a morfologie MSC. Neadherentní buňky budou odstraněny a médium doplněno.

   - Polovina média se bude měnit každé 3 dny.

   - Baňky budou hodnoceny, dokud buňky nedosáhnou 80-90% konfluence.

   • MSC budou sklizeny pomocí Trypsin-EDTA (0,25 %) po dobu 5 minut. Poté bude působení trypsinu zastaveno přidáním autologního séra.
   • MSC budou promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS), spočítány a testovány na životaschopnost pomocí vylučovacího testu trypanové modři.
   • MSC budou identifikovány pomocí imunofenotypových markerů (pozitivní pro CD44 a negativní pro CD34).
   • Buňky budou suspendovány ve sterilním fyziologickém roztoku, minimálně 20 x 106 buněk MSC v 10 cm3 injekční stříkačce, připravené pro injekci.

   Bude provedena kontrola kvality sterility pomocí bakteriálních aerobních a anaerobních kultur, aby byly zajištěny úplné aseptické podmínky během odběru, přípravy, skladování a injekce vzorku. (Gunetti et al., 2012)

6. Injekce buněk:

   Pacient bude umístěn do litotomické polohy. Foleyův katétr (velikost 18) bude zaveden do močové trubice, poté v lokální anestezii; odebrané buňky (celkem 20-30 milionů buněk na pacienta v 10cc injekční stříkačce) (Sebe et al., 2011) budou injikovány do submukózní tkáně na úrovni proximální uretry těsně distálně od hrdla močového měchýře (vedení natažením na Foleyho katetr), ve 3, 9, 12 hodin, injekcí přibližně 3,5 cm3 do každého místa.

7. Vaginální páska bez napětí (TVT):

   Dalších 25 pacientek podstoupí chirurgický zákrok, kterým je operace „beznapěťové vaginální pásky“ na porodnicko-gynekologickém oddělení – Porodnice Ain Shams – urogynekologická jednotka. Při této technice se provede malá miduretrální incize ve vaginální sliznici, poté se polypropylenová páska se síťkou 40*1 cm připevněná ke dvěma zakřiveným trokarům protáhne laterálně od močové trubice a přes endopelvickou fascii do retropubického prostoru. Trokar bude poté veden podél zadní části stydké kosti přes přímou fascii ve dvou malých suprapubických kožních řezech, poté se napětí na pásce upraví a zbývající páska se odřízne na úrovni kůže.

8. Následovat:

Následné návštěvy budou prováděny 3 měsíce, 6 měsíců, 9 měsíců a 12 měsíců po terapii. Bude provedeno klinické vyšetření, dotazník pro inkontinenci, dotazník kvality života a urodynamická studie.

** Sběr a záznam dat:

Každý pacient bude mít formulář pro záznam případu (CRF), ve kterém budou zaznamenány následující údaje:

• Věk, rovnost
• Index tělesné hmotnosti (BMI).
• Typ intervence (terapie kmenovými buňkami nebo TVT)
• Mezinárodní konzultace k dotazníku o inkontinenci – krátký formulář o inkontinenci moči (ICIQ-UI SF) při přijetí a 3 m, 6 m, 9 m, 12 m po injekci.
• Skóre kvality života při inkontinenci (I-QOL) při příjmu a 3 m, 6 m, 9 m, 12 m po injekci.
• Test kašle při příjmu a 3 m, 6 m, 9 m, 12 m po injekci.

• Urodynamická studie při příjmu a 3m, 6m, 9m, 12m po injekci.

  • Statistická analýza:

Popisná statistika pro měřené proměnné bude vyjádřena jako rozsah, průměr a směrodatná odchylka (pro metrická data); rozsah, medián a mezikvartilový rozsah (pro diskrétní data); a počet a proporce (pro kategorická data). Nálezy před injekcí a po injekci budou porovnány pomocí t-testu nebo Wilcoxonova testu v závislosti na tom, zda naměřené parametry byly Gaussovy proměnné. P-hodnota 0,05 nebo méně bude považována za statisticky významnou.

** Etická hlediska:

1. Delegování povinností vyšetřovatele:

   Zkoušející zajistí, aby všechny osoby pomáhající při hodnocení byly přiměřeně informovány o protokolu a jejich povinnostech a funkcích souvisejících s hodnocením. Zkoušející bude vést seznam dílčích zkoušejících a dalších náležitě kvalifikovaných osob, na které delegoval významné povinnosti související s hodnocením.

2. Informace pro pacienta a informovaný souhlas Před přijetím do klinické studie musí pacient souhlasit s účastí poté, co mu byla vysvětlena povaha, rozsah a možné důsledky klinické studie formou pro ni srozumitelnou. Dokument informovaného souhlasu v arabském jazyce obsahuje všechny místně požadované prvky a specifikuje, kdo informoval pacienta. Po přečtení dokumentu o informovaném souhlasu musí pacient dát souhlas písemně. Souhlas pacienta musí být při udělení souhlasu potvrzen vlastnoručně datovaným podpisem pacienta a vlastnoručně datovaným podpisem osoby, která vede rozhovory o informovaném souhlasu. Pokud pacient není schopen číst, ústní prezentace a vysvětlení formuláře písemného informovaného souhlasu a informací, které mají být pacientům poskytnuty, musí proběhnout za přítomnosti nestranného svědka. Souhlas musí být potvrzen při udělení souhlasu ústně a vlastnoručně datovaným podpisem pacienta nebo místní právně uznávanou alternativou (např. otiskem palce nebo značkou pacienta). Svědek a osoba, která vede rozhovory o informovaném souhlasu, musí dokument souhlasu také podepsat a osobně datovat. Originál podepsaného dokumentu o souhlasu si zkoušející ponechá. Zkoušející neprovede žádná opatření specificky požadovaná pouze pro klinickou studii, dokud nezíská platný souhlas.
3. Důvěrnost Do CRF bude zaznamenáno pouze číslo pacienta a iniciály pacienta, a pokud se jméno pacienta objeví na jakémkoli jiném dokumentu, musí jej vyšetřovatelé uchovávat v soukromí. Zkoušející bude udržovat osobní identifikační seznam pacientů (čísla pacientů s odpovídajícími jmény pacientů), aby bylo možné záznamy identifikovat.
4. Schválení protokolu Před zahájením studie a v souladu s místními předpisy bude protokol a všechny odpovídající dokumenty prohlášeny za etické a výzkumné schválení radou porodnického oddělení Univerzity Ain Shams; podle Helsinské deklarace WMA.