Terapia con cellule staminali per il trattamento dell'incontinenza urinaria da sforzo femminile

** Ambienti di studio: lo studio si terrà presso l'ospedale di maternità dell'Università di Ain-Shams - unità di uroginecologia; reclutare i pazienti dall'ambulatorio di uroginecologia

** Misura di prova:

Cinquanta pazienti di sesso femminile con incontinenza urinaria da stress dovuta a deficit intrinseco dello sfintere saranno reclutate in due gruppi; il gruppo A comprendente 25 pazienti saranno iniettati con cellule staminali, e questi saranno i pazienti che rifiutano l'intervento chirurgico come linea primaria di trattamento o non idonei per l'intervento chirurgico. Gruppo B; di cui 25 pazienti, subiranno l'operazione del nastro vaginale senza tensione. La dimensione del campione è determinata secondo la seguente equazione:

[ P1( 100-P1) + P2( 100-P2) ] / (P2 - P1)2 dove; Potenza del test = 80% Livello di confidenza = 95% Errore alfa = 5% Assumendo un tasso di successo per l'intervento preferibilmente utilizzato "nastro vaginale senza tensione" in pazienti con deficit intrinseco dello sfintere P1=80% ( Schierlitz et al, 2008).

Assumendo un tasso di successo per la terapia con cellule staminali P2= 90% (Smaldone et al, 2009).

** Intervento:

1. Consenso Il consenso informato sarà preso secondo la Dichiarazione di Helsinki della World Medical Association (WMA); i principi etici per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani.
2. Anamnesi Verrà prelevata l'anamnesi completa di ogni paziente, insieme a una storia dettagliata per quanto riguarda le abitudini minzionali, l'incontinenza, la disfunzione minzionale, l'infezione urinaria. Verranno ottenuti questionari sull'incontinenza e questionari sulla qualità della vita.
3. Esame Esame fisico e pelvico completo per valutare la presenza di incontinenza urinaria da sforzo e per escludere pazienti con marcata ipermobilità dell'uretra o grave cistocele o rettocele.
4. Studio urodinamico Verrà eseguito uno studio urodinamico multicanale utilizzando Euet Sensik ® comprendente cistometria, misurazione della pressione uretrale, misurazione della pressione del punto di perdita addominale (ALPP) e misurazione dell'urina residua. Saranno selezionati pazienti con incontinenza urinaria da sforzo dovuta a deficienza intrinseca dello sfintere. I criteri per la selezione sono: assenza di contrazioni involontarie durante la perdita causata da una manovra di stress; basso ALPP (<60 cmH2O); & pressione massima di chiusura uretrale (MUCP) <20-30 cmH2O. Saranno esclusi i pazienti con disfunzione minzionale (volume residuo urinario >100ml).

5. Recupero, coltura ed elaborazione delle cellule:

   * Aspirazione del midollo osseo:

   -Sito: cresta iliaca posteriore superiore.

   -Procedura: Il paziente viene posto in posizione di decubito laterale, con la parte superiore della gamba flessa e la parte inferiore della gamba tesa. La cresta iliaca viene palpata e il sito di campionamento preferito viene contrassegnato con una penna. Viene impiegata una tecnica asettica, inclusi guanti e camice sterili. Il sito viene preparato con un antisettico (povidone-iodio), strofinato e drappeggiato, esponendo solo il sito da campionare. La pelle e il tessuto sottostante al periostio vengono infiltrati con un anestetico locale (circa 10 mL di xilocaina all'1% [lidocaina]). Una siringa da 10 ml con un ago calibro 25 viene utilizzata per iniettare un primo 0,5 ml direttamente sotto la pelle, sollevando un pomfo. Un ago calibro 22 viene utilizzato per penetrare più in profondità nel tessuto sottocutaneo e nel periostio sottostante, un'area di circa 1 cm di diametro. Viene praticata un'incisione cutanea con una piccola lama chirurgica, attraverso la quale viene inserito l'ago per l'aspirazione del midollo osseo, con uno stiletto bloccato in posizione. Una volta che l'ago entra in contatto con l'osso, viene fatto avanzare ruotando lentamente in senso orario e antiorario finché l'osso corticale non viene penetrato e la cavità del midollo viene inserita. La profondità della penetrazione non dovrebbe estendersi oltre un 1 cm iniziale. Una volta all'interno della cavità midollare, lo stiletto viene rimosso. Utilizzando una siringa da 20 ml, vengono aspirati circa 5 ml di midollo osseo. I campioni successivi vengono ottenuti collegando una siringa separata, raccogliendo 5 mL alla volta. I campioni vengono quindi trasferiti in una provetta contenente acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). L'ago del midollo viene rimosso e la pressione viene applicata al sito di aspirazione con una garza fino a quando l'emorragia non si ferma.

   * Elaborazione e coltura delle cellule:

   - Cellule mononucleate (MNCs) saranno isolate mediante centrifugazione in gradiente di densità usando Ficol/Hypaque.

   - Le cellule staminali mesenchimali (MSC) saranno isolate mediante adesione plastica mediante semina di MNC in fiasche di coltura tissutale T25 in terreno di coltura completo (DMEM, 1% antibiotici/antimicotici, 20% siero autologo). Le fiasche saranno incubate a 37ºC in incubatore a CO2 per 3-5 giorni.

   - Dopo 5 giorni, le fiasche saranno valutate al microscopio invertito per il numero e la morfologia delle MSC. Le cellule non aderenti saranno scartate e il terreno sarà reintegrato.

   - La metà del mezzo verrà cambiata ogni 3 giorni.

   - Le fiasche saranno valutate fino a quando le cellule non raggiungeranno circa l'80-90% di confluenza.

   • Le MSC saranno raccolte usando tripsina-EDTA (0.25%) per 5 minuti. Successivamente, l'azione della tripsina sarà bloccata mediante l'aggiunta di siero autologo.
   • Le MSC saranno lavate usando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), contate, testate per la vitalità usando il test di esclusione del tripan blu.
   • Le MSC saranno identificate utilizzando marcatori immunofenotipici (positivi per CD44 e negativi per CD34).
   • Le cellule saranno sospese in soluzione salina sterile, un minimo di 20 X 106 cellule MSC in una siringa da 10 cc, pronte per l'iniezione.

   Verrà eseguito il controllo di qualità per la sterilità mediante l'esecuzione di colture batteriche aerobiche e anaerobiche per garantire le condizioni asettiche complete durante il prelievo, la preparazione, la conservazione e l'iniezione del campione. (Gunetti et al., 2012)

6. Iniezione di cellule:

   Il paziente sarà posto in posizione litotomica. Un catetere di Foley (misura 18) verrà inserito nell'uretra, quindi in anestesia locale; cellule recuperate (totale 20-30 milioni di cellule per paziente in siringa da 10 cc) (Sebe et al., 2011) saranno iniettate nel tessuto sottomucoso a livello dell'uretra prossimale appena distale al collo vescicale (guidate dallo stiramento sulla catetere), a ore 3,9,12, iniettando circa 3,5 cc in ogni sede.

7. Nastro vaginale senza tensione (TVT):

   Altre 25 pazienti saranno sottoposte a intervento chirurgico, ovvero l'operazione di "cerotto vaginale senza tensione" presso il reparto di ostetricia e ginecologia - Ain Shams Maternity Hospital - unità di uroginecologia. In questa tecnica, verrà praticata una piccola incisione medio-uretrale nella mucosa vaginale, quindi un nastro in rete di polipropilene da 40 * 1 cm attaccato a due trocar curvi verrà fatto passare lateralmente all'uretra e attraverso la fascia endopelvica nello spazio retropubico. Il trocar verrà quindi passato lungo la parte posteriore dell'osso pubico, attraverso la fascia del retto, in due piccole incisioni cutanee sovrapubiche, quindi la tensione sul nastro verrà regolata e il nastro rimanente verrà tagliato a livello della pelle.

8. Seguito:

Le visite di follow-up saranno condotte a 3 mesi, 6 mesi, 9 mesi e 12 mesi dopo la terapia. Verranno eseguiti esame clinico, questionario sull'incontinenza, questionario sulla qualità della vita e studio urodinamico.

** Raccolta e registrazione dei dati:

Ogni paziente avrà a disposizione una scheda di registrazione (CRF) nella quale verranno registrati i seguenti dati:

• Età, parità
• Indice di massa corporea (BMI).
• Tipo di intervento (terapia con cellule staminali o TVT)
• Consultazione internazionale sull'incontinenza Questionario-Forma breve sull'incontinenza urinaria (ICIQ-UI SF) all'ammissione e 3m, 6m, 9m, 12m post-iniezione.
• Punteggio dello strumento per la qualità della vita dell'incontinenza (I-QOL) al momento del ricovero e 3 m, 6 m, 9 m, 12 m dopo l'iniezione.
• Test della tosse all'ingresso e 3m, 6m, 9m, 12m dopo l'iniezione.

• Studio urodinamico all'ingresso e 3m, 6m, 9m, 12m post-iniezione.

  • Analisi statistica:

Le statistiche descrittive per le variabili misurate saranno espresse come range, media e deviazione standard (per i dati metrici); range, mediana e range interquartile (per dati discreti); e numero e proporzioni (per i dati categorici). I risultati pre-iniezione e post-iniezione saranno confrontati utilizzando il test t o il test di Wilcoxon a seconda che i parametri misurati fossero variabili gaussiane. Un valore P di 0,05 o inferiore sarà considerato statisticamente significativo.

** Considerazioni etiche:

1. Delega delle responsabilità dell'investigatore:

   L'investigatore assicurerà che tutte le persone che assistono allo studio siano adeguatamente informate sul protocollo e sui loro doveri e funzioni relativi allo studio. L'investigatore manterrà un elenco di sub-investigatori e altra persona adeguatamente qualificata a cui ha delegato compiti significativi relativi al processo.

2. Informazioni per il paziente e consenso informato Prima di essere ammesso allo studio clinico, il paziente deve acconsentire a partecipare dopo che la natura, la portata e le possibili conseguenze dello studio clinico sono state spiegate in una forma a lei comprensibile. Un documento di consenso informato, in lingua araba, contiene tutti gli elementi richiesti a livello locale e specifica chi ha informato il paziente. Dopo aver letto il documento di consenso informato, il paziente deve dare il consenso per iscritto. Il consenso del paziente deve essere confermato al momento del consenso dalla firma personale datata del paziente e dalla firma personale datata della persona che conduce le discussioni sul consenso informato. Se il paziente non è in grado di leggere, la presentazione orale e la spiegazione del modulo di consenso informato scritto e delle informazioni da fornire ai pazienti deve avvenire alla presenza di un testimone imparziale. Il consenso deve essere confermato al momento del consenso oralmente e dalla firma personale datata del paziente o da un'alternativa locale legalmente riconosciuta (ad esempio, l'impronta digitale o il marchio del paziente). Il testimone e la persona che conduce le discussioni sul consenso informato devono anche firmare e datare personalmente il documento di consenso. Il documento di consenso originale firmato sarà conservato dallo sperimentatore. Lo sperimentatore non intraprenderà alcuna misura specificamente richiesta solo per lo studio clinico fino a quando non avrà ottenuto un consenso valido.
3. Riservatezza Solo il numero del paziente e le iniziali del paziente saranno registrati nella CRF, e se il nome del paziente appare su qualsiasi altro documento, deve essere tenuto in privato dagli investigatori. Lo sperimentatore manterrà un elenco personale di identificazione dei pazienti (numeri dei pazienti con i corrispondenti nomi dei pazienti) per consentire l'identificazione dei record.
4. Approvazione del protocollo Prima dell'inizio dello studio e in conformità con il regolamento locale seguito, il protocollo e tutti i documenti corrispondenti saranno dichiarati per l'approvazione etica e di ricerca dal consiglio del dipartimento di ostetricia, Università di Ain Shams; secondo la Dichiarazione WMA di Helsinki.