Infekce EBV související s transfuzí mezi dětskými příjemci alogenní transplantace kmenových buněk (TREASuRE)

Všichni pacienti budou přijati přibližně 1 měsíc před transplantací (před předtransplantační přípravnou chemoterapií a předoperačním hodnocením) a sledováni až 1 rok po transplantaci. Každý subjekt bude tedy sledován po dobu 13 měsíců. Při vstupu budou dotazníkem dokumentovány sociodemografické údaje a předtransplantační klinické ukazatele jako věk, pohlaví, primární diagnóza, předchozí chemoterapie, předchozí transfuze atd. Během sledování umožní formuláře kazuistik (CRF) prospektivní hlášení všech proměnných týkajících se sérologie EBV, transplantace, transfuze krevních produktů a komplikací EBV.

EBV PCR a sérologické vyšetření:

Tato studie je observační a bude využívat výsledky EBV PCR a EBV sérologie, což umožní dosáhnout našich cílů se značným snížením nákladů. Čas nula je, když pacient obdrží svůj štěp. Některé testy se provádějí před časem nula (předtransplantační řada testů včetně sérologie EBV). Po čase nula je na všech pracovištích následný léčebný protokol včetně EBV PCR testování. Předtransplantační séra od příjemců a dárců jsou standardními metodami testována na protilátky proti imunoglobulinu G (IgG) proti kapsidovému antigenu EBV (VCA), IgG protilátky proti časným antigenům EBV (EA) a antikomplementové protilátky proti jaderným antigenům EBV (EBNA). Testování EBV DNA se provádí pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (PCR). Každé centrum má stanovenou prahovou hodnotu pro stanovení virové zátěže. Aby bylo možné správně interpretovat údaje o virové náloži pacientů z každého zúčastněného centra, všichni budou muset vyplnit formulář zprávy o místě (SRF), v němž popíšou svou testovací metodu pro EBV PCR a EBV sérologii.

Předtransplantační měření protilátek proti EBV:

Sérologické vyšetření, včetně séroprevalence EBV, se vždy provádí na všech zúčastněných místech během předtransplantačního hodnocení (před přípravnou chemoterapií) u dárců i příjemců. Sérologické vyšetření je test, který se používá k potvrzení přítomnosti viru v krvi. U štěpů poskytovaných externími pracovišti jsou vzorky krve dárců vždy k dispozici a umožní sérologické vyšetření v laboratorním centru, kde se transplantace provádí. Sérologické vyšetření se u dárce pupečníkové krve nebude provádět, protože je prakticky vždy negativní na EBV. Dárci a příjemci budou klasifikováni podle jejich sérologického stavu před transplantací jako: 1) s prodělanou infekcí (titry IgG VCA a EBNA > 10), 2) s nedávnou infekcí nebo s potlačenou imunitou (titry IgG VCA > 10 a titry EBNA IgG < 10), 3) s reaktivovanou infekcí (titry IgG VCA, EBNA a EA > 10) nebo 4) bez předchozí infekce (bez sérologických známek předchozí infekce).

Potransplantační EBV DNA PCR testování:

Příjemci HSCT jsou v potransplantačním období pečlivě sledováni kvůli infekci EBV. Ačkoli většina transfuzí krevních produktů probíhá během peritransplantačního období, je možné, že pacienti dostanou krevní produkty později po transplantaci. Sledování výsledků EBV PCR a komplikací souvisejících s EBV proto bude pokračovat až jeden rok po transplantaci (nebo do doby úmrtí). Toto časové okno umožní dokumentaci celé klinické trajektorie HSCT. Protokoly pro sledování po transplantaci a pro diagnostiku a léčbu onemocnění EBV u příjemců alogenních štěpů byly přezkoumány na všech zúčastněných pracovištích. Výskyt infekce EBV u příjemců se měří pomocí kvantitativního testování PCR v reálném čase, které se provádí MINIMÁLNĚ každé 1-2 týdny od okamžiku transplantace do propuštění z nemocnice (což je obvykle přibližně 6 týdnů po transplantaci). Po propuštění z nemocnice se při každé klinické následné návštěvě provádí monitorování EBV PCR: NEJMÉNĚ dvakrát za měsíc po dobu přibližně 4-6 měsíců po transplantaci nebo tak dlouho, dokud pacient zůstává imunosuprimován. Poté se provádí přibližně jedna EBV PCR za měsíc až do 1 roku po transplantaci.

Stručně řečeno, výskyt EBV infekce bude adekvátně měřen během 1-letého období sledování. Na všech pracovištích se provádí NEJMÉNĚ 1 EBV PCR test za 1-2 týdny během hospitalizace, 2 EBV PCR testy za měsíc od propuštění z nemocnice do 6 měsíců po transplantaci a přibližně 1 EBV PCR test za měsíc od 6 měsíců do 12 měsíců. Celkový počet výsledků EBV PCR, které budou shromážděny u jednoho pacienta za celé sledování, bude přibližně 18. Tyto výsledky budou získány z tabulek pacientů.

PTLD a další komplikace související s EBV:

Klinické výsledky, jako je vysoká a zvyšující se virová zátěž EBV infekce a PTLD, budou rutinně vyšetřovány do jednoho roku po transplantaci. Diagnóza PTLD bude provedena podle kritérií WHO (Swerdlow et al, 2008) na základě klinických nebo radiologických příznaků koexistujících s EBV-pozitivní PCR na krevních vzorcích. Informace související s PTLD budou shromážděny ve formuláři zprávy o případu. Budou také dokumentovány všechny další komplikace, které mohou s EBV souviset (například: hemofagocytární syndrom, hepatitida atd.). Rozhodčí komise (C. Buteau a C Alfieri) prozkoumají datové prvky specifické pro pacienta, aby potvrdily PTLD a další komplikace související s EBV.

Transfuzní krevní produkty:

Údaje o všech transfuzovaných krevních produktech budou shromažďovány a budou obsahovat deskriptory jednotky krevního produktu (typ krevního produktu, počet jednotek, délka skladování atd.), transfundovaný objem (mililitry), dobu trvání transfuze a také datum a čas každé transfuze. V naší analýze bude zohledněn celkový přijatý objem všech krevních produktů a také počet transfuzí.

Každé zúčastněné centrum také vyplní formulář pro hlášení místa (SRF), aby zdokumentoval svůj transfuzní protokol, jako je typ krevních produktů použitých pro HSCT, leukoredukci, typ červených krvinek (RBC) (myté, ozářené, CMV negativní atd. .), typ plazmy (čerstvě zmrazená plazma, zmrazená plazma, solventní detergentní plazma), typ koncentrátů krevních destiček (aferéza, pool, atd.), maximální délka skladování (dny) atd.

Určení zdroje EBV u těžkých infekcí EBV:

Abychom definitivně prokázali, že virus z transfuzních krevních produktů může být spojen se závažnými komplikacemi, jako je vysoká a zvyšující se virová zátěž EBV infekce/PTLD, budeme genotypovat kmen EBV od těchto pacientů. Krevní jednotky podané těmto pacientům budou zpětně vysledovány k dárcům, kteří budou (se souhlasem) následně sérologicky vyšetřeni na EBV a u všech séropozitivních dárců bude genotypován jejich kmen EBV pro srovnání s kmenem pacienta. Mnoho dárců krve na jeden případ bude muset být vysledováno, protože příjemci dostávají krevní produkty od mnoha dárců krve (1 jednotku červených krvinek poskytuje 1 dárce, 1 jednotku plazmy poskytuje 1 dárce a 1 jednotku krevních destiček poskytují 4 dárci) . V průměru jsme očekávali, že na jeden případ bude třeba dohledat asi 25 dárců (odhad s pilotními údaji; Trottier et al, 2012). Používáme se při sledování dárců krve příjemců štěpu, jak uvádí Alfieri et al. (1996).

Stručný postup pro genotypizaci EBV:

10 ml krve (2 ml u infikovaných dětských pacientů) se oddělí hustotní centrifugací na gradientech Ficoll-hypaque. Frakce mononukleárních buněk se sklidí, promyje a kultivuje v přítomnosti cyklosporinu, aby se umožnil růst EBV-pozitivních buněk dárce a vytvoření imortalizované EBV-pozitivní B buněčné linie. Virová DNA v této linii pak může být amplifikována pomocí PCR s použitím primerů z oblasti BamHI-K genomu EBV, o které je známo, že je vysoce polymorfní mezi různými kmeny EBV. Různé velikosti fragmentů amplifikované oblasti lze rozlišit migrací na agarózovém gelu (Alfieri et al, 1996). Abychom ověřili naše výsledky ohledně identity mezi pacienty a dárci krve, použijeme také EBNA-typizační techniku, která se provádí analýzou western blot s použitím definovaného EBNA-pozitivního séra (Alfieri et al, 1996).