Infezione da EBV correlata alla trasfusione tra i pazienti pediatrici sottoposti a trapianto di cellule staminali allogeniche (TREASuRE)

Tutti i pazienti verranno reclutati circa 1 mese prima del trapianto (prima della chemioterapia di condizionamento pre-trapianto e della valutazione pre-operatoria) e seguiti fino a 1 anno dopo il trapianto. Pertanto, ogni soggetto sarà seguito per un periodo di 13 mesi. All'ingresso, un questionario documenterà i dati socio-demografici e gli indicatori clinici pre-trapianto quali età, sesso, diagnosi primaria, precedente chemioterapia, precedente trasfusione, ecc. Durante il follow-up, i moduli di segnalazione dei casi (CRF) consentiranno la segnalazione prospettica di tutte le variabili relative alla sierologia dell'EBV, al trapianto, alla trasfusione di emoderivati ​​e alle complicanze dell'EBV.

EBV PCR e test sierologici:

Questo studio è osservazionale e utilizzerà i risultati della PCR EBV e della sierologia EBV consentendo di raggiungere i nostri obiettivi con una notevole riduzione dei costi. Il tempo zero è quando il paziente riceve il suo innesto. Alcuni test vengono eseguiti prima del tempo zero (array di test pre-trapianto che include la sierologia EBV). Dopo il tempo zero, in tutti i siti, esiste un protocollo di trattamento di follow-up che include il test EBV PCR. I sieri pre-trapianto di riceventi e donatori vengono testati con metodi standard per gli anticorpi mmunoglobulina G (IgG) contro l'antigene del capside dell'EBV (VCA), gli anticorpi IgG contro gli antigeni precoci dell'EBV (EA) e gli anticorpi anticomplemento contro gli antigeni nucleari dell'EBV (EBNA). Il test del DNA di EBV viene eseguito mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR). Ogni centro ha un valore soglia stabilito per la determinazione della carica virale. Al fine di interpretare correttamente i dati sulla carica virale dei pazienti da ciascun centro partecipante, tutti dovranno compilare un modulo di segnalazione del sito (SRF) per descrivere il loro metodo di test per EBV PCR e sierologia EBV.

Misurazione pre-trapianto degli anticorpi EBV:

I test sierologici, inclusa la sieroprevalenza dell'EBV, vengono sempre eseguiti in tutti i siti partecipanti durante la valutazione pre-trapianto (prima del condizionamento della chemioterapia) sia nei donatori che nei riceventi. Il test sierologico è il test utilizzato per confermare la presenza del virus nel sangue. Per gli innesti forniti da siti esterni, i campioni di sangue del donatore sono sempre disponibili e consentiranno di eseguire i test sierologici presso il centro laboratorio in cui viene eseguito il trapianto. Il test sierologico non verrà eseguito sul donatore di sangue del cordone ombelicale in quanto è praticamente sempre negativo per EBV. I donatori e i riceventi saranno classificati in base al loro stato sierologico pre-trapianto come: 1) con infezione pregressa (titoli VCA e EBNA IgG > 10), 2) con infezione recente o immunosoppressi (titoli VCA IgG > 10 e titoli EBNA IgG < 10), 3) con infezione riattivata (titoli VCA, EBNA e EA IgG > 10), o 4) essere naïve (nessun segno sierologico di precedente infezione).

Test PCR del DNA EBV post-trapianto:

I trapiantati vengono seguiti attentamente per l'infezione da EBV nel periodo post-trapianto. Sebbene la maggior parte delle trasfusioni di emoderivati ​​avvenga durante il periodo peri-trapianto, è possibile che i pazienti ricevano emoderivati ​​in un momento successivo al trapianto. Il follow-up dei risultati della PCR EBV e delle complicanze correlate all'EBV continuerà quindi fino a un anno dopo il trapianto (o al momento del decesso). Questa finestra temporale consentirà la documentazione dell'intera traiettoria clinica dell'HSCT. I protocolli per il follow-up dopo il trapianto e per la diagnosi e il trattamento della malattia da EBV nei riceventi di trapianto allogenico sono stati rivisti in tutti i siti partecipanti. L'incidenza dell'infezione da EBV nei riceventi è misurata mediante test PCR quantitativi in ​​tempo reale eseguiti ALMENO ogni 1-2 settimane dal momento del trapianto fino alla dimissione dall'ospedale (che di solito è di circa 6 settimane dopo il trapianto). Dopo la dimissione dall'ospedale, il monitoraggio EBV PCR viene eseguito ad ogni visita clinica di follow-up: ALMENO due volte al mese per circa 4-6 mesi dopo il trapianto o fino a quando il paziente rimane immunosoppresso. Successivamente, viene eseguita circa una PCR EBV al mese fino a 1 anno dopo il trapianto.

In sintesi, l'incidenza dell'infezione da EBV sarà adeguatamente misurata durante un periodo di follow-up di 1 anno. In tutti i centri, viene eseguito ALMENO 1 test EBV PCR ogni 1-2 settimane durante il ricovero, 2 test EBV PCR al mese dalla dimissione dall'ospedale fino a 6 mesi dopo il trapianto e circa 1 test EBV PCR al mese da 6 mesi a 12 mesi. Il numero totale di risultati PCR EBV che verranno raccolti per paziente per l'intero follow-up sarà di circa 18. Questi risultati verranno recuperati dalle cartelle dei pazienti.

PTLD e altre complicazioni legate all'EBV:

Gli esiti clinici come l'infezione da EBV con carica virale elevata e in aumento e PTLD saranno sottoposti a screening di routine fino a un anno dopo il trapianto. La diagnosi di PTLD sarà effettuata secondo i criteri dell'OMS (Swerdlow et al, 2008) sulla base di segni clinici o radiologici coesistenti con una PCR positiva per EBV su campioni di sangue. Le informazioni relative al PTLD saranno raccolte nel modulo di segnalazione del caso. Verranno inoltre documentate tutte le altre complicanze eventualmente correlate all'EBV (ad esempio: sindrome emofagocitica, epatite, ecc.). Una commissione giudicatrice (C. Buteau e C Alfieri) esamineranno gli elementi dei dati specifici del paziente per confermare il PTLD e altre complicanze legate all'EBV.

Emoderivati ​​trasfusi:

Saranno raccolti dati su tutti gli emoderivati ​​trasfusi e includeranno descrittori dell'unità di emocomponenti (tipo di emoderivato, numero di unità, durata della conservazione, ecc.), volume trasfuso (millilitri), durata della trasfusione, nonché la data e l'ora di ogni trasfusione. Il volume totale ricevuto di ogni emoderivato sarà considerato nella nostra analisi così come il numero di trasfusioni.

Un modulo di segnalazione del sito (SRF) sarà inoltre compilato da ciascun centro partecipante per documentare il proprio protocollo trasfusionale come il tipo di emoderivati ​​utilizzati per HSCT, leucoriduzione, tipo di globuli rossi (RBC) (lavati, irradiati, CMV negativi, ecc. .), tipo di plasma (plasma fresco congelato, plasma congelato, plasma solvente detergente), tipo di concentrati piastrinici (aferesi, pooled, ecc.), durata massima di conservazione (giorni), ecc.

Determinazione della fonte di EBV nelle gravi infezioni da EBV:

Al fine di dimostrare definitivamente che il virus degli emoderivati ​​trasfusi può essere collegato a gravi complicanze come l'infezione da EBV/PTLD ad alta e crescente carica virale, genotipizzeremo il ceppo EBV di questi pazienti. Le unità di sangue somministrate a questi pazienti verranno ricondotte ai donatori che a loro volta (con il consenso) saranno valutati sierologicamente per EBV e tutti i donatori sieropositivi avranno il loro ceppo EBV genotipizzato per il confronto con il ceppo del paziente. Dovranno essere rintracciati molti donatori di sangue per caso poiché i riceventi ricevono emoderivati ​​da molti donatori di sangue (1 unità di RBC è fornita da 1 donatore, 1 unità di plasma è fornita da 1 donatore e 1 unità di piastrine è fornita da 4 donatori) . In media, ci aspettavamo di dover rintracciare circa 25 donatori per caso (stimato con dati pilota; Trottier et al, 2012). Siamo utilizzati per rintracciare donatori di sangue di riceventi di trapianto come riportato in Alfieri et al. (1996).

Breve procedura per la genotipizzazione di EBV:

10 ml di sangue (2 ml per i pazienti pediatrici infetti) vengono separati mediante centrifugazione per densità su gradienti di Ficoll-hypaque. La frazione di cellule mononucleate viene raccolta, lavata e coltivata in presenza di ciclosporina in modo da consentire la crescita delle cellule EBV-positive del donatore e l'istituzione di una linea cellulare B EBV-positiva immortalizzata. Il DNA virale all'interno di questa linea può quindi essere amplificato mediante PCR utilizzando primer dalla regione BamHI-K del genoma EBV, che è noto per essere altamente polimorfico tra i vari ceppi EBV. I frammenti di diverse dimensioni della regione amplificata possono essere distinti per migrazione su gel di agarosio (Alfieri et al, 1996). Al fine di verificare i nostri risultati per l'identità tra pazienti e donatori di sangue utilizzeremo anche la tecnica di tipizzazione EBNA che viene eseguita mediante analisi western blot utilizzando un siero definito EBNA-positivo (Alfieri et al, 1996).