Transfuusioon liittyvä EBV-infektio allogeenisten kantasolusiirtojen lasten keskuudessa (TREASuRE)

Kaikki potilaat rekrytoidaan noin 1 kuukausi ennen elinsiirtoa (ennen siirtoa edeltävää ehdollistavaa kemoterapiaa ja leikkausta edeltävää arviointia) ja seurantaa 1 vuoden ajan transplantaation jälkeen. Siten jokaista aihetta seurataan 13 kuukauden ajan. Saapumisen yhteydessä kyselylomakkeella dokumentoidaan sosiodemografiset tiedot ja siirtoa edeltävät kliiniset indikaattorit, kuten ikä, sukupuoli, ensisijainen diagnoosi, aiempi kemoterapia, aikaisempi verensiirto jne. Seurannan aikana tapausraporttilomakkeet (CRF) mahdollistavat kaikkien EBV-serologiaan, siirtoon, verivalmisteen siirtoon ja EBV-komplikaatioihin liittyvien muuttujien raportoinnin.

EBV PCR ja serologiset testit:

Tämä tutkimus on havainnollinen, ja siinä käytetään EBV PCR:n ja EBV-serologian tuloksia, mikä mahdollistaa tavoitteemme saavuttamisen kustannussäästöillä. Aika nolla on silloin, kun potilas saa siirteensä. Jotkut testit tehdään ennen kuin aika nolla (pre-transplant-testisarja, mukaan lukien EBV-serologia). Nollaajan jälkeen kaikissa paikoissa on seurantahoitoprotokolla, joka sisältää EBV PCR -testauksen. Vastaanottajilta ja luovuttajilta saadut seerumit ennen siirtoa testataan standardimenetelmillä EBV-kapsidiantigeenin (VCA) immunoglobuliini G (IgG) vasta-aineiden, EBV:n varhaisten antigeenien (EA) IgG-vasta-aineiden ja EBV:n ydinantigeenien (EBNA) vasta-aineiden vasta-aineiden suhteen. EBV DNA-testaus suoritetaan kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Jokaisella keskuksella on vahvistettu kynnysarvo viruskuorman määrittämiseksi. Jotta kunkin osallistuvan keskuksen potilaiden viruskuormatiedot voidaan tulkita oikein, kaikkien on täytettävä sivustoraporttilomake (SRF), jossa kuvataan EBV PCR:n ja EBV-serologian testausmenetelmänsä.

EBV-vasta-aineiden mittaus ennen siirtoa:

Serologiset testit, mukaan lukien EBV:n seroprevalenssi, tehdään aina kaikissa osallistuvissa paikoissa siirtoa edeltävän arvioinnin aikana (ennen ehdollista kemoterapiaa) sekä luovuttajille että vastaanottajille. Serologinen testi on testi, jolla varmistetaan viruksen esiintyminen veressä. Ulkopuolelta toimitetuista siirteistä luovuttajan verinäytteitä on aina saatavilla, ja ne mahdollistavat serologisen testauksen laboratoriokeskuksessa, jossa siirto suoritetaan. Serologisia testejä ei tehdä napanuoraveren luovuttajille, koska se on käytännössä aina negatiivinen EBV:n suhteen. Luovuttajat ja vastaanottajat luokitellaan siirtoa edeltävän serologisen statuksensa mukaan seuraavasti: 1) heillä on aiempi infektio (VCA- ja EBNA-IgG-tiitterit > 10), 2) heillä on äskettäinen infektio tai heillä on immuunivaste (VCA IgG-tiitterit > 10 ja EBNA IgG-tiitterit) < 10), 3) jolla on uudelleen aktivoitunut infektio (VCA-, EBNA- ja EA IgG-tiitterit > 10) tai 4) on naiivi (ei serologisia merkkejä aikaisemmasta infektiosta).

Transplantation jälkeinen EBV DNA PCR -testaus:

HSCT-vastaanottajia seurataan tarkasti EBV-infektion varalta transplantaation jälkeisenä aikana. Vaikka suurin osa verivalmisteiden siirroista tapahtuu siirtoa edeltävänä aikana, on mahdollista, että potilaat saavat verivalmisteita myöhemmin siirron jälkeen. EBV:n PCR-tulosten ja EBV:hen liittyvien komplikaatioiden seurantaa jatketaan siksi jopa vuoden ajan transplantaation (tai kuolemanajan) jälkeen. Tämä aikaikkuna mahdollistaa HSCT:n koko kliinisen liikeradan dokumentoinnin. Elinsiirron jälkeistä seurantaa sekä allogeenisten siirteen vastaanottajien EBV-taudin diagnosointia ja hoitoa koskevat protokollat ​​on tarkistettu kaikissa osallistuvissa paikoissa. EBV-infektion ilmaantuvuus vastaanottajilla mitataan kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR-testillä, joka suoritetaan VÄHINTÄÄN 1-2 viikon välein elinsiirrosta sairaalasta kotiutumiseen (joka on yleensä noin 6 viikkoa transplantaation jälkeen). Sairaalasta kotiutumisen jälkeen EBV PCR -seuranta suoritetaan jokaisella kliinisellä seurantakäynnillä: VÄHINTÄÄN kahdesti kuukaudessa noin 4-6 kuukauden ajan transplantaation jälkeen tai niin kauan kuin potilaan immuunivaste on heikentynyt. Sen jälkeen suoritetaan noin yksi EBV PCR kuukaudessa, kunnes on kulunut 1 vuosi transplantaation jälkeen.

Yhteenvetona voidaan todeta, että EBV-infektion ilmaantuvuus mitataan riittävästi yhden vuoden seurantajakson aikana. Kaikilla paikoilla tehdään VÄHINTÄÄN 1 EBV PCR -testi 1-2 viikossa sairaalahoidon aikana, 2 EBV PCR -testiä kuukaudessa sairaalasta kotiuttamisesta 6 kuukauteen transplantaation jälkeen ja noin 1 EBV PCR -testi kuukaudessa 6 kuukaudesta 12 kuukauteen. EBV PCR -tulosten kokonaismäärä, joka kerätään potilasta kohti koko seurannan aikana, on noin 18. Nämä tulokset haetaan potilaskartoista.

PTLD ja muut EBV:hen liittyvät komplikaatiot:

Kliiniset tulokset, kuten korkea ja lisääntyvä viruskuorma EBV-infektio ja PTLD, seulotaan rutiininomaisesti vuoden ajan transplantaation jälkeen. PTLD-diagnoosi tehdään WHO:n kriteerien mukaisesti (Swerdlow et al, 2008) kliinisten tai radiologisten merkkien perusteella, jotka esiintyvät rinnakkain verinäytteiden EBV-positiivisen PCR:n kanssa. PTLD:hen liittyvät tiedot kerätään tapausraporttilomakkeelle. Myös kaikki muut EBV:hen mahdollisesti liittyvät komplikaatiot (esimerkiksi hemofagosyyttisyndrooma, hepatiitti jne.) dokumentoidaan. Tuomarilautakunta (C. Buteau ja C Alfieri) tarkistavat potilaskohtaiset tietoelementit PTLD:n ja muiden EBV:hen liittyvien komplikaatioiden vahvistamiseksi.

Siirretyt verituotteet:

Tiedot kaikista siirretyistä verivalmisteista kerätään ja sisältävät verivalmisteyksikön kuvaukset (verivalmisteen tyyppi, yksiköiden lukumäärä, säilytysaika jne.), siirretyn määrän (millilitraa), siirron keston sekä jokaisen verensiirron päivämäärä ja kellonaika. Analyysissamme otetaan huomioon jokaisen verituotteen vastaanotettu kokonaismäärä sekä verensiirtojen määrä.

Jokainen osallistuva keskus täyttää myös paikkaraporttilomakkeen (SRF) dokumentoidakseen verensiirtoprotokollansa, kuten HSCT:ssä käytettyjen verituotteiden tyypin, leukoreduktion, punasolujen tyypin (pestyt, säteilytetyt, CMV-negatiiviset jne. .), plasmatyyppi (tuore pakastettu plasma, pakastettu plasma, liuotinpesuaineplasma), verihiutaletiivisteiden tyyppi (afereesi, poolattu jne.), säilytysajan enimmäispituus (päiviä) jne.

EBV:n lähteen määrittäminen vaikeissa EBV-infektioissa:

Osoittaaksemme lopullisesti, että siirretyistä verituotteista peräisin oleva virus voi olla yhteydessä vakaviin komplikaatioihin, kuten korkeaan ja kasvavaan viruskuormaan EBV-infektioon/PTLD:hen, genotyypisimme näiden potilaiden EBV-kannan. Näille potilaille annetut veriyksiköt jäljitetään luovuttajiin, joille vuorostaan ​​(suostumuksella) tehdään serologinen EBV-arviointi, ja kaikille seropositiivisille luovuttajille tehdään EBV-kannan genotyypitys, jotta sitä voidaan verrata potilaan kantaan. Monet verenluovuttajat tapausta kohden on jäljitettävä, koska vastaanottajat saavat verituotteita useilta verenluovuttajilta (1 luovuttaja toimittaa 1 punasoluyksikön, 1 luovuttaja toimittaa 1 yksikkö plasmaa ja 4 luovuttajaa 1 yksikkö verihiutaleita) . Keskimäärin odotimme, että tapausta kohden on jäljitettävä noin 25 luovuttajaa (arvioitu pilottitiedoilla; Trottier et al, 2012). Meitä käytetään siirteen vastaanottajien verenluovuttajien jäljittämiseen, kuten Alfieri et al. (1996).

Lyhyt menettely EBV-genotyypitykseen:

10 ml verta (2 ml infektoituneille lapsipotilaille) erotetaan tiheyssentrifugoinnilla Ficoll-hypaque-gradienteilla. Mononukleaarinen solufraktio kerätään, pestään ja viljellään syklosporiinin läsnä ollessa luovuttajan EBV-positiivisten solujen uloskasvun mahdollistamiseksi ja immortalisoidun EBV-positiivisen B-solulinjan muodostamiseksi. Tämän linjan virus-DNA voidaan sitten monistaa PCR:llä käyttämällä alukkeita EBV-genomin BamHI-K-alueelta, jonka tiedetään olevan erittäin polymorfinen eri EBV-kantojen joukossa. Monistetun alueen erikokoiset fragmentit voidaan erottaa migraatiolla agaroosigeelillä (Alfieri et ai, 1996). Varmistaaksemme tulosten identiteetin potilaiden ja verenluovuttajien välillä käytämme myös EBNA-tyypitystekniikkaa, joka suoritetaan Western blot -analyysillä käyttämällä määriteltyä EBNA-positiivista seerumia (Alfieri et ai, 1996).