Infecção por EBV relacionada à transfusão entre receptores pediátricos de transplante de células-tronco alogênicas (TREASuRE)

Todos os pacientes serão recrutados aproximadamente 1 mês antes do transplante (antes da quimioterapia de condicionamento pré-transplante e avaliação pré-cirúrgica) e acompanhados até 1 ano após o transplante. Assim, cada sujeito será acompanhado por um período de 13 meses. Na entrada, um questionário documentará dados sociodemográficos e indicadores clínicos pré-transplante, como idade, sexo, diagnóstico principal, quimioterapia anterior, transfusão anterior, etc. Durante o acompanhamento, os formulários de relato de caso (CRF) permitirão o relato prospectivo de todas as variáveis ​​relacionadas à sorologia do EBV, transplante, transfusão de hemoderivados e complicação do EBV.

Teste de PCR e sorologia para EBV:

Este estudo é observacional e utilizará os resultados de EBV PCR e sorologia EBV permitindo que nossos objetivos sejam alcançados com considerável redução de custos. O tempo zero é quando o paciente recebe seu enxerto. Alguns testes são feitos antes do tempo zero (série de testes pré-transplante, incluindo sorologia para EBV). Após o tempo zero, em todos os locais, existe um protocolo de tratamento de acompanhamento, incluindo teste de EBV PCR. Os soros pré-transplante de receptores e doadores são testados por métodos padrão para anticorpos de imunoglobulina G (IgG) para o antígeno do capsídeo EBV (VCA), anticorpos IgG para antígenos precoces de EBV (EA) e anticorpos anticomplemento para antígenos nucleares de EBV (EBNA). O teste de DNA do EBV é realizado por reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa. Cada centro tem um valor limite estabelecido para determinar a carga viral. Para interpretar adequadamente os dados de carga viral dos pacientes de cada centro participante, todos deverão preencher um formulário de relatório do local (SRF) para descrever seu método de teste para EBV PCR e sorologia para EBV.

Medição pré-transplante de anticorpos EBV:

O teste de sorologia, incluindo soroprevalência de EBV, é sempre feito em todos os locais participantes durante a avaliação pré-transplante (antes da quimioterapia condicionante) em doadores e receptores. O teste de sorologia é o teste usado para confirmar a presença do vírus no sangue. Para enxertos fornecidos por sites externos, amostras de sangue do doador estão sempre disponíveis e permitirão testes de sorologia no centro laboratorial onde o transplante é realizado. O teste de sorologia não será feito no doador de sangue do cordão umbilical, pois é quase sempre negativo para EBV. Doadores e receptores serão classificados de acordo com seu status sorológico pré-transplante como: 1) com infecção passada (títulos VCA e EBNA IgG > 10), 2) infecção recente ou imunossuprimido (títulos VCA IgG > 10 e títulos EBNA IgG < 10), 3) com infecção reativada (títulos de VCA, EBNA e EA IgG > 10) ou 4) naïve (sem sinal sorológico de infecção prévia).

Teste de PCR de DNA de EBV pós-transplante:

Receptores de TCTH são acompanhados de perto para infecção por EBV no período pós-transplante. Embora a maioria das transfusões de hemoderivados ocorra durante o período peritransplante, é possível que os pacientes recebam hemoderivados posteriormente após o transplante. O acompanhamento dos resultados da PCR do EBV e das complicações relacionadas ao EBV continuará, portanto, até um ano após o transplante (ou hora da morte). Essa janela de tempo permitirá a documentação de toda a trajetória clínica do TCTH. Os protocolos de acompanhamento após o transplante e para o diagnóstico e tratamento da doença EBV em receptores de enxertos alogênicos foram revisados ​​em todos os locais participantes. A incidência de infecção por EBV em receptores é medida por testes quantitativos de PCR em tempo real realizados NO MÍNIMO a cada 1-2 semanas desde o momento do transplante até a alta hospitalar (que geralmente é cerca de 6 semanas após o transplante). Após a alta hospitalar, o monitoramento de EBV PCR é realizado em todas as visitas de acompanhamento clínico: PELO MENOS duas vezes por mês durante aproximadamente 4-6 meses após o transplante ou enquanto o paciente permanecer imunossuprimido. A partir daí, aproximadamente um EBV PCR por mês é realizado até 1 ano pós-transplante.

Em suma, a incidência de infecção por EBV será medida adequadamente durante um período de acompanhamento de 1 ano. Em todos os locais, pelo menos 1 teste de EBV PCR é feito por 1-2 semanas durante a hospitalização, 2 testes de EBV PCR por mês desde a alta hospitalar até 6 meses após o transplante e aproximadamente 1 teste de EBV PCR por mês de 6 meses a 12 meses. O número total de resultados de EBV PCR que serão coletados por paciente durante todo o acompanhamento será de aproximadamente 18. Esses resultados serão recuperados dos prontuários dos pacientes.

PTLD e outras complicações relacionadas ao EBV:

Desfechos clínicos, como infecção por EBV de carga viral alta e crescente e PTLD, serão rastreados rotineiramente até um ano após o transplante. O diagnóstico de DLPT será feito de acordo com os critérios da OMS (Swerdlow et al, 2008) com base em sinais clínicos ou radiológicos coexistindo com PCR positivo para EBV em amostras de sangue. As informações relacionadas ao PTLD serão coletadas no formulário de relato de caso. Todas as outras complicações possivelmente relacionadas ao EBV (por exemplo: síndrome hemofagocítica, hepatite, etc.) também serão documentadas. Uma comissão julgadora (C. Buteau e C Alfieri) revisará elementos de dados específicos do paciente para confirmar PTLD e outras complicações relacionadas ao EBV.

Hemoderivados transfundidos:

Os dados de todos os hemoderivados transfundidos serão coletados e incluirão descritores da unidade de hemoderivado (tipo de hemoderivado, número de unidades, tempo de armazenamento, etc.), volume transfundido (mililitros), duração da transfusão, bem como a data e a hora de cada transfusão. O volume total recebido de todos os hemoderivados será considerado em nossa análise, bem como o número de transfusões.

Um formulário de relatório do local (SRF) também será preenchido por cada centro participante para documentar seu protocolo de transfusão, como o tipo de hemoderivados usados ​​para HSCT, leucorredução, tipo de glóbulos vermelhos (RBCs) (lavados, irradiados, CMV negativos, etc. .), tipo de plasma (plasma fresco congelado, plasma congelado, plasma solvente detergente), tipo de concentrado de plaquetas (aférese, pool, etc.), tempo máximo de armazenamento (dias), etc.

Determinando a fonte de EBV em infecções graves por EBV:

A fim de demonstrar definitivamente que o vírus de hemoderivados transfundidos pode estar ligado a complicações graves, como infecção por EBV/PTLD com carga viral alta e crescente, iremos genotipar a cepa de EBV desses pacientes. As unidades de sangue administradas a esses pacientes serão rastreadas até os doadores que, por sua vez (com consentimento), serão avaliados sorologicamente para EBV, e todos os doadores soropositivos terão sua cepa de EBV genotipada para comparação com a cepa do paciente. Muitos doadores de sangue por caso terão que ser rastreados, pois os receptores recebem produtos sanguíneos de muitos doadores de sangue (1 unidade de RBC é fornecida por 1 doador, 1 unidade de plasma é fornecida por 1 doador e 1 unidade de plaquetas é fornecida por 4 doadores) . Em média, esperamos que cerca de 25 doadores tenham que ser rastreados por caso (estimado com dados piloto; Trottier et al, 2012). Somos usados ​​no rastreamento de doadores de sangue de receptores de enxerto conforme relatado em Alfieri et al. (1996).

Procedimento breve para genotipagem de EBV:

10 ml de sangue (2 ml para pacientes pediátricos infectados) são separados por centrifugação de densidade em gradientes Ficoll-hypaque. A fração de células mononucleares é colhida, lavada e cultivada na presença de ciclosporina de modo a permitir o crescimento das células EBV-positivas do doador e o estabelecimento de uma linhagem de células B EBV-positivas imortalizadas. O DNA viral dentro desta linha pode então ser amplificado por PCR usando primers da região BamHI-K do genoma do EBV, que é conhecido por ser altamente polimórfico entre as várias cepas de EBV. Os fragmentos de tamanhos diferentes da região amplificada podem ser distinguidos pela migração em um gel de agarose (Alfieri et al, 1996). A fim de verificar nossos resultados para identidade entre pacientes e doadores de sangue, também empregaremos a técnica de tipagem de EBNA, que é realizada por análise de western blot usando um soro positivo para EBNA definido (Alfieri et al, 1996).