Инфекция EBV, связанная с трансфузией, среди педиатрических реципиентов аллогенной трансплантации стволовых клеток (TREASuRE)

Все пациенты будут набраны примерно за 1 месяц до трансплантации (перед предтрансплантационной кондиционирующей химиотерапией и предоперационной оценкой) и будут наблюдаться в течение 1 года после трансплантации. Таким образом, каждый субъект будет находиться под наблюдением в течение 13 месяцев. При входе в анкету будут задокументированы социально-демографические данные и клинические показатели до трансплантации, такие как возраст, пол, первичный диагноз, предыдущая химиотерапия, предыдущее переливание крови и т. д. Во время последующего наблюдения формы истории болезни (CRF) позволят проспективно сообщать обо всех переменных, относящихся к серологии ВЭБ, трансплантации, переливании продуктов крови и осложнениях, вызванных ВЭБ.

ВЭБ ПЦР и серологическое тестирование:

Это исследование носит наблюдательный характер и будет использовать результаты ПЦР на ВЭБ и серологию на ВЭБ, что позволит достичь наших целей при значительном снижении затрат. Нулевой момент наступает, когда пациент получает свой трансплантат. Некоторые тесты проводятся до нулевого времени (массив тестов перед трансплантацией, включая серологию EBV). После нулевого времени во всех центрах существует протокол последующего лечения, включающий ПЦР-тестирование на EBV. Предтрансплантационные сыворотки реципиентов и доноров тестируют стандартными методами на антитела иммуноглобулина G (IgG) к капсидному антигену ВЭБ (VCA), антитела IgG к ранним антигенам ВЭБ (EA) и антикомплементарные антитела к ядерным антигенам ВЭБ (EBNA). Тестирование ДНК ВЭБ проводится с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). В каждом центре установлено пороговое значение для определения вирусной нагрузки. Чтобы правильно интерпретировать данные о вирусной нагрузке пациентов из каждого участвующего центра, все должны будут заполнить форму отчета о месте (SRF), чтобы описать свой метод тестирования на EBV PCR и серологию EBV.

Измерение антител к ВЭБ перед трансплантацией:

Серологическое тестирование, включая серопревалентность EBV, всегда проводится во всех участвующих центрах во время предтрансплантационной оценки (перед кондиционирующей химиотерапией) как у доноров, так и у реципиентов. Серологическое тестирование — это тест, который используется для подтверждения присутствия вируса в крови. Для трансплантатов, предоставленных внешними центрами, всегда доступны образцы донорской крови, что позволит провести серологическое тестирование в лабораторном центре, где проводится трансплантация. Серологическое тестирование донора пуповинной крови не проводится, так как оно практически всегда дает отрицательный результат на ВЭБ. Доноры и реципиенты будут классифицированы в соответствии с их серологическим статусом перед трансплантацией на: 1) имеющие перенесенную инфекцию (титры IgG VCA и EBNA > 10), 2) имеющие недавнюю инфекцию или иммуносупрессивные (титры VCA IgG > 10 и титры IgG EBNA) < 10), 3) с реактивированной инфекцией (титры VCA, EBNA и EA IgG > 10) или 4) наивные (отсутствие серологических признаков предшествующей инфекции).

ПЦР-тестирование ДНК ВЭБ после трансплантации:

Реципиенты ТГСК тщательно наблюдают на предмет заражения ВЭБ в посттрансплантационном периоде. Хотя большинство переливаний продуктов крови происходит в перитрансплантационном периоде, возможно, что пациенты получают продукты крови в более позднее время после трансплантации. Таким образом, последующее наблюдение за результатами ПЦР на EBV и осложнениями, связанными с EBV, будет продолжаться до одного года после трансплантации (или во время смерти). Это временное окно позволит документировать всю клиническую траекторию ТГСК. Протоколы последующего наблюдения после трансплантации, а также диагностики и лечения ВЭБ у реципиентов аллогенных трансплантатов были рассмотрены во всех участвующих центрах. Заболеваемость EBV-инфекцией у реципиентов измеряется с помощью количественного ПЦР-тестирования в реальном времени, проводимого МИНИМУМ каждые 1-2 недели с момента трансплантации до выписки из больницы (что обычно происходит через 6 недель после трансплантации). После выписки из стационара ПЦР-мониторинг EBV проводится при каждом последующем клиническом посещении: ПО КРАЙНЕЙ МЕРЕ два раза в месяц в течение примерно 4-6 месяцев после трансплантации или до тех пор, пока у пациента сохраняется подавленный иммунитет. После этого проводится примерно одна ПЦР на EBV в месяц до 1 года после трансплантации.

Таким образом, заболеваемость EBV-инфекцией будет адекватно измерена в течение 1 года наблюдения. Во всех учреждениях проводится ПО КРАЙНЕЙ МЕРЕ 1 ПЦР-тест на EBV каждые 1-2 недели во время госпитализации, 2 ПЦР-теста на EBV в месяц с момента выписки из стационара до 6 месяцев после трансплантации и приблизительно 1 ПЦР-тест на EBV в месяц в период от 6 до 12 месяцев. Общее количество результатов ПЦР на ВЭБ, которые будут получены на одного пациента за все время наблюдения, составит приблизительно 18. Эти результаты будут извлечены из карт пациентов.

ПТЛЗ и другие осложнения, связанные с ВЭБ:

Клинические исходы, такие как инфекция EBV с высокой и растущей вирусной нагрузкой и PTLD, будут регулярно проверяться в течение одного года после трансплантации. Диагноз ПТЛЗ будет поставлен в соответствии с критериями ВОЗ (Swerdlow et al, 2008) на основании клинических или радиологических признаков, сосуществующих с EBV-положительной ПЦР в образцах крови. Информация, связанная с PTLD, будет собрана в форме отчета о случае. Все другие осложнения, возможно, связанные с ВЭБ (например, гемофагоцитарный синдром, гепатит и т. д.), также будут задокументированы. Судейская комиссия (С. Buteau и C. Alfieri) рассмотрят элементы данных по конкретным пациентам, чтобы подтвердить PTLD и другие осложнения, связанные с EBV.

Продукты переливания крови:

Будут собираться данные обо всех перелитых продуктах крови, которые будут включать дескрипторы единицы продукта крови (тип продукта крови, количество единиц, продолжительность хранения и т. д.), объем переливания (миллилитры), продолжительность переливания, а также дату и время каждого переливания. В нашем анализе будет учитываться общий объем полученного каждого продукта крови, а также количество переливаний.

Форма отчета о месте (SRF) также будет заполнена каждым участвующим центром для документирования его протокола переливания, такого как тип продуктов крови, используемых для ТГСК, лейкоредукция, тип эритроцитов (эритроциты) (отмытые, облученные, ЦМВ-отрицательные и т. д.). .), тип плазмы (свежезамороженная плазма, замороженная плазма, плазма с растворителем-детергентом), тип концентратов тромбоцитов (аферез, объединенный и т. д.), максимальный срок хранения (дни) и т. д.

Определение источника ВЭБ при тяжелых ВЭБ-инфекциях:

Чтобы окончательно продемонстрировать, что вирус из перелитых продуктов крови может быть связан с серьезными осложнениями, такими как высокая и увеличивающаяся вирусная нагрузка EBV-инфекции/PTLD, мы проведем генотипирование штамма EBV у этих пациентов. Единицы крови, введенные этим пациентам, будут прослежены до доноров, которые, в свою очередь (с согласия), будут подвергнуты серологической оценке на ВЭБ, а штамм ВЭБ всех серопозитивных доноров будет генотипирован для сравнения со штаммом пациента. Необходимо отслеживать большое количество доноров крови в каждом случае, поскольку реципиенты получают продукты крови от многих доноров крови (1 единица эритроцитов предоставляется 1 донором, 1 единица плазмы предоставляется 1 донором и 1 единица тромбоцитов предоставляется 4 донорами). . В среднем мы ожидали, что в каждом случае придется отслеживать около 25 доноров (оценка на основе пилотных данных; Trottier et al, 2012). Нас используют для отслеживания доноров крови реципиентов трансплантатов, как сообщалось в Alfieri et al. (1996).

Краткая процедура генотипирования ВЭБ:

10 мл крови (2 мл для инфицированных детей) отделяют центрифугированием по плотности на градиентах Ficoll-Hypaque. Фракцию мононуклеарных клеток собирают, промывают и культивируют в присутствии циклоспорина, чтобы обеспечить рост донорских EBV-положительных клеток и создание иммортализованной EBV-положительной В-клеточной линии. Вирусная ДНК в этой линии затем может быть амплифицирована с помощью ПЦР с использованием праймеров из области BamHI-K генома EBV, которая, как известно, высоко полиморфна среди различных штаммов EBV. Фрагменты амплифицированной области разного размера можно различить по миграции на агарозном геле (Alfieri et al., 1996). Чтобы проверить наши результаты на идентичность между пациентами и донорами крови, мы также будем использовать метод EBNA-типирования, который выполняется с помощью вестерн-блоттинга с использованием определенной EBNA-положительной сыворотки (Alfieri et al, 1996).