Zakażenie EBV związane z transfuzją wśród pediatrycznych biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych (TREASuRE)

Wszyscy pacjenci zostaną zrekrutowani około 1 miesiąc przed przeszczepem (przed chemioterapią kondycjonującą przed przeszczepem i oceną przedoperacyjną) i będą poddani obserwacji do 1 roku po przeszczepie. Tak więc każdy pacjent będzie obserwowany przez okres 13 miesięcy. Przy wejściu kwestionariusz będzie dokumentował dane socjodemograficzne i wskaźniki kliniczne przed przeszczepem, takie jak wiek, płeć, podstawowa diagnoza, poprzednia chemioterapia, poprzednia transfuzja itp. Podczas obserwacji formularze opisów przypadków (CRF) umożliwią prospektywne raportowanie wszystkich zmiennych dotyczących serologii EBV, transplantacji, transfuzji produktów krwiopochodnych i powikłań EBV.

EBV PCR i testy serologiczne:

To badanie ma charakter obserwacyjny i wykorzysta wyniki EBV PCR i serologii EBV, umożliwiając osiągnięcie naszych celów przy znacznej redukcji kosztów. Czas zero to moment, w którym pacjent otrzymuje przeszczep. Niektóre testy są wykonywane przed czasem zero (szereg testów przed przeszczepem, w tym serologia EBV). Po czasie zero we wszystkich ośrodkach obowiązuje protokół dalszego leczenia, w tym test EBV PCR. Surowice przed przeszczepem od biorców i dawców są badane standardowymi metodami na obecność przeciwciał mmunoglobuliny G (IgG) przeciwko antygenowi kapsydowemu EBV (VCA), przeciwciał IgG przeciwko wczesnym antygenom EBV (EA) i przeciwciał przeciwko dopełniaczowi przeciwko antygenom jądrowym EBV (EBNA). Badanie DNA EBV przeprowadza się metodą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Każdy ośrodek ma ustaloną wartość progową do określania wiremii. W celu prawidłowej interpretacji danych dotyczących wiremii pacjentów z każdego uczestniczącego ośrodka, wszystkie uczestniczące ośrodki będą musiały wypełnić formularz zgłoszenia miejsca (SRF) w celu opisania metody testowania EBV PCR i serologii EBV.

Pomiar przeciwciał EBV przed przeszczepem:

Testy serologiczne, w tym seroprewalencji EBV, są zawsze wykonywane we wszystkich uczestniczących ośrodkach podczas oceny przed przeszczepem (przed chemioterapią kondycjonującą) zarówno u dawców, jak i biorców. Testy serologiczne to testy stosowane w celu potwierdzenia obecności wirusa we krwi. W przypadku przeszczepów dostarczonych przez ośrodki zewnętrzne próbki krwi dawcy są zawsze dostępne i umożliwiają wykonanie badań serologicznych w ośrodku laboratoryjnym, w którym wykonywany jest przeszczep. Testy serologiczne nie będą wykonywane na dawcy krwi pępowinowej, ponieważ jest on praktycznie zawsze ujemny w kierunku EBV. Dawcy i biorcy zostaną sklasyfikowani zgodnie z ich statusem serologicznym przed przeszczepem jako: 1) z przebytą infekcją (miana VCA i EBNA IgG > 10), 2) z niedawną infekcją lub immunosupresją (miana VCA IgG > 10 i miana EBNA IgG) < 10), 3) z reaktywacją infekcji (miana VCA, EBNA i EA IgG > 10), lub 4) nieleczony (brak serologicznych objawów wcześniejszej infekcji).

Badanie PCR DNA EBV po przeszczepie:

Biorcy HSCT są ściśle obserwowani pod kątem zakażenia EBV w okresie po przeszczepie. Chociaż większość transfuzji produktów krwiopochodnych ma miejsce w okresie okołoprzeszczepowym, możliwe jest, że pacjenci otrzymują preparaty krwiopochodne w późniejszym czasie po przeszczepie. Kontynuacja wyników EBV PCR i powikłań związanych z EBV będzie zatem kontynuowana do jednego roku po przeszczepie (lub śmierci). To okno czasowe pozwoli na udokumentowanie całej trajektorii klinicznej HSCT. We wszystkich uczestniczących ośrodkach dokonano przeglądu protokołów obserwacji po przeszczepie oraz diagnozy i leczenia choroby EBV u allogenicznych biorców przeszczepów. Częstość występowania zakażenia EBV u biorców jest mierzona za pomocą ilościowych testów PCR w czasie rzeczywistym, wykonywanych MINIMALNIE co 1-2 tygodnie od czasu przeszczepu do wypisu ze szpitala (czyli zwykle około 6 tygodni po przeszczepie). Po wypisaniu ze szpitala monitorowanie EBV PCR przeprowadza się podczas każdej wizyty kontrolnej: PRZYNAJMNIEJ dwa razy w miesiącu przez około 4-6 miesięcy po przeszczepie lub tak długo, jak długo pacjent pozostaje z obniżoną odpornością. Następnie wykonuje się około jednego testu EBV PCR miesięcznie do 1 roku po przeszczepie.

Podsumowując, częstość występowania zakażenia EBV zostanie odpowiednio zmierzona podczas rocznej obserwacji. We wszystkich ośrodkach CO NAJMNIEJ 1 test EBV PCR jest wykonywany co 1-2 tygodnie podczas hospitalizacji, 2 testy EBV PCR na miesiąc od wypisu ze szpitala do 6 miesięcy po przeszczepie i około 1 test EBV PCR na miesiąc od 6 do 12 miesięcy. Łączna liczba wyników EBV PCR, które zostaną zebrane na pacjenta w całym okresie obserwacji, wyniesie około 18. Wyniki te zostaną pobrane z kart pacjentów.

PTLD i inne powikłania związane z EBV:

Wyniki kliniczne, takie jak infekcja EBV o wysokim i rosnącym mianie wirusa oraz PTLD, będą rutynowo badane do jednego roku po przeszczepie. Diagnoza PTLD zostanie postawiona zgodnie z kryteriami WHO (Swerdlow i in., 2008) w oparciu o objawy kliniczne lub radiologiczne współistniejące z dodatnim wynikiem PCR w kierunku EBV w próbkach krwi. Informacje dotyczące PTLD zostaną zebrane w formularzu opisu przypadku. Wszystkie inne powikłania prawdopodobnie związane z EBV (na przykład: zespół hemofagocytarny, zapalenie wątroby itp.) również zostaną udokumentowane. Komisja orzekająca (C. Buteau i C Alfieri) dokonają przeglądu elementów danych specyficznych dla pacjenta, aby potwierdzić PTLD i inne powikłania związane z EBV.

Przetaczane produkty krwiopochodne:

Gromadzone będą dane dotyczące wszystkich przetoczonych preparatów krwiopochodnych, które będą zawierać deskryptory jednostki preparatu krwiopochodnego (rodzaj preparatu krwiopochodnego, liczba jednostek, długość przechowywania itp.), przetoczoną objętość (mililitry), czas trwania transfuzji, a także datę i godzinę każdej transfuzji. W naszej analizie zostanie uwzględniona całkowita objętość otrzymanych produktów krwiopochodnych oraz liczba transfuzji.

Każdy uczestniczący ośrodek wypełni również formularz raportu z miejsca (SRF) w celu udokumentowania swojego protokołu transfuzji, takiego jak rodzaj produktów krwiopochodnych używanych do HSCT, leukoredukcja, rodzaj krwinek czerwonych (RBC) (przemyte, napromieniowane, CMV-ujemne itp.) .), rodzaj osocza (świeżo mrożone osocze, mrożone osocze, osocze rozpuszczalnikowo-detergentowe), rodzaj koncentratów płytek krwi (afereza, pulowanie itp.), maksymalny czas przechowywania (dni) itp.

Określenie źródła EBV w ciężkich zakażeniach EBV:

W celu ostatecznego wykazania, że ​​wirus z przetoczonych produktów krwiopochodnych może być powiązany z poważnymi powikłaniami, takimi jak infekcja EBV/PTLD o wysokim i wzrastającym mianie wirusa, przeprowadzimy genotypowanie szczepu EBV pobranego od tych pacjentów. Jednostki krwi podawane tym pacjentom będą identyfikowane od dawców, którzy z kolei (za zgodą) zostaną poddani ocenie serologicznej w kierunku EBV, a wszyscy seropozytywni dawcy będą mieli genotypowany szczep EBV w celu porównania ze szczepem pacjenta. Wielu dawców krwi na przypadek będzie musiało zostać wyśledzonych, ponieważ biorcy otrzymują preparaty krwi od wielu dawców (1 jednostka krwinek czerwonych jest dostarczana przez 1 dawcę, 1 jednostka osocza jest dostarczana przez 1 dawcę i 1 jednostka płytek krwi jest dostarczana przez 4 dawców). . Średnio spodziewaliśmy się, że na przypadek trzeba będzie prześledzić około 25 dawców (szacunkowo na podstawie danych pilotażowych; Trottier i in., 2012). Jesteśmy wykorzystywani do śledzenia dawców krwi biorców przeszczepów, jak podano w Alfieri i in. (1996).

Krótka procedura genotypowania EBV:

10 ml krwi (2 ml w przypadku zakażonych pacjentów pediatrycznych) oddziela się przez wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll-hypaque. Frakcję komórek jednojądrzastych zbiera się, przemywa i hoduje w obecności cyklosporyny, aby umożliwić wzrost komórek EBV-dodatnich dawcy i ustanowienie unieśmiertelnionej linii komórek B EBV-dodatnich. Wirusowe DNA w tej linii można następnie zamplifikować metodą PCR przy użyciu starterów z regionu BamHI-K genomu EBV, o którym wiadomo, że jest wysoce polimorficzny wśród różnych szczepów EBV. Fragmenty amplifikowanego regionu o różnej wielkości można rozróżnić przez migrację na żelu agarozowym (Alfieri i in., 1996). Aby zweryfikować nasze wyniki pod kątem tożsamości między pacjentami a dawcami krwi, zastosujemy również technikę typowania EBNA, która jest wykonywana przez analizę Western blot przy użyciu określonej surowicy dodatniej pod względem EBNA (Alfieri i in., 1996).