Slouží lidský střevní mikrobiom jako nový personalizovaný terapeutický cíl pro koronární aterosklerózu?

Úvod:

Lidský gastrointestinální systém je osídlen řadou symbiotických mikroorganismů, jmenovitě mikrobiotou. Jeho celková hmotnost je přibližně 2 kilogramy, obsahuje biliony mikroorganismů. Mikrobiom jsou celková genetická (metagenomická) data mikrobioty. V posledních letech vývoj účinných metod pro sekvenování genomu a bioinformatiku umožnil rychlou a přesnou kvantifikaci a kvalifikaci mikrobiomu, čímž se analýza mikrobiomu stala vedoucí metodou výzkumu mikrobioty.

Onemocnění koronárních tepen (CAD) má na svědomí více než 8 milionů úmrtí ročně po celém světě. Zejména akutní koronární syndrom (ACS) zůstává hlavní příčinou morbidity a mortality a je odpovědný za více než 1 milion hospitalizací ve Spojených státech ročně. Patofyziologickým znakem AKS je koronární trombóza způsobená poraněním aterosklerotického plátu, přičemž jsou popsány dva typy poranění. Prvním je ruptura plátu, která zůstává nejčastější příčinou koronární aterotrombózy, druhým je povrchová eroze plátu, která je rozpoznávána stále častěji. Na rozdíl od ruptury plaku, léze způsobené erozí nemají tenké vláknité čepičky, hojné zánětlivé buňky nebo velké lipidové jádro, ale spíše bohaté na extracelulární matrix, jako jsou proteoglykany a glykosaminoglykany.

Zobrazovací studie, jako je koronární počítačová tomografická angiografie (CCTA) a diagnostické koronární katetrizace s optickou koherentní tomografií (OCT) nebo bez ní, se v klinické praxi stále více používají k charakterizaci mechanismu odpovědného za nestabilní/zranitelný aterosklerotický plát.

Lidská střevní mikroflóra intenzivně interaguje s hostitelem prostřednictvím metabolické výměny a ko-metabolismu substrátů; tím přispívají k řadě metabolických a imunologických mechanismů v lidském těle. CAD je hlavní oblastí zájmu ve výzkumu mikrobioty a existuje několik zjištění, které spojují střevní mikroflóru s patofyziologií CAD. Za prvé, mikrobiota byla spojena s metabolickým syndromem, konkrétně s obezitou a inzulinovou rezistencí. Předpokládá se, že střevní mikroflóra může zvyšovat mastné kyseliny s krátkým řetězcem, které nakonec zvyšují chuť k jídlu, a tak způsobují obezitu. Další hypotézou je, že endotoxiny střevní mikroflóry se mohou translokovat do krevního řečiště, vyvolat zánětlivou kaskádu, která nakonec podpoří aterosklerózu. Zadruhé, mikroflóra může také hrát roli ve vývoji aterosklerózy. U pacientů se symptomatickou aterosklerózou existuje jedinečný vzor mikrobiomu, který může mít prozánětlivé vlastnosti. Nedávno byl nalezen unikátní mikrobiální vzorec u pacientů s vysokým kardiovaskulárním rizikovým profilem. Za třetí, střevní mikroflóra metabolizuje fosfatidylcholin (lecitin) v potravě za vzniku metabolitu trimethylamin-N-oxidu (TMAO), který je spojen se zvýšeným rizikem kardiovaskulárních příhod.

Dosud publikovaná data se týkají výhradně interakce mezi lidským střevním mikrobiomem a kardiovaskulárními rizikovými faktory. Podle nejlepšího vědomí a porozumění zkoušejícího chybí analýza mikrobiomu pacientů se stanovenou diagnózou ICHS (včetně AKS).

Cíle:

Účelem této studie je vyšetřit střevní mikroflóru pacientů se symptomatickou ICHS, a to jak ve stabilních, tak v akutních fázích. Vyšetřovatelé předpokládají, že účastníci studie budou prezentovat jedinečný mikrobiomový podpis, který může poskytnout nový pohled na patofyziologii aterosklerotické ICHS a zároveň poskytnout domnělé terapeutické důsledky.

Po stanovení jedinečného mikrobiomového podpisu u velké kohorty pacientů s CAD by jej výzkumníci korelovali s hladinami TMAO, aby dále prozkoumali jeho roli v patofyziologii CAD. V konečné fázi by se vyšetřovatelé pokusili najít způsoby, jak upravit personalizované možnosti léčby, aby se změnila „proaterosklerotická“ střevní mikroflóra. S využitím dat ze současné studie s předchozí kohortou 1000 pacientů vyšetřovatelů se známým mikrobiomem a nutričním profilem by bylo možné hledat specifický cíl pro nutriční intervenci, jako jsou probiotika. Poté by vyšetřovatelé monitorovali pacienty se sekvenováním mikrobiomu po nutriční intervenci.

Metody:

Návrh studia a nábor. Účastníky studie budou pacienti ve věku 30–80 let, kteří dorazí do Rabin Medical Center s podezřením na ICHS a budou schopni poskytnout informovaný souhlas. Účastníci poskytnou lékařské, životní a výživové dotazníky. Během hospitalizace bude provedeno měření krevního tlaku a srdeční frekvence, stejně jako krevní testy a vzorky stolice a/nebo rektální výtěry. Za účelem vyhodnocení a/nebo léčby podezření na aterosklerotické onemocnění podstoupí účastníci CT srdce a/nebo srdeční katetrizaci v souladu se standardem péče a na základě rozhodnutí ošetřujícího kardiologa. Diagnostika a možnosti léčby budou založeny pouze na zdravotním stavu účastníků a bez ohledu na výše uvedený protokol studie.

Kontrolní skupina bude vybrána tak, aby reprezentovala skupinu odpovídající věku, pohlaví a kardiovaskulárním rizikovým faktorům bez současné ICHS. Dalšími vylučovacími kritérii v kontrolní skupině bude spotřeba antibiotik v následujících 3 měsících, zánětlivé onemocnění střev nebo jiné významné chronické onemocnění, které může ovlivnit mikrobiotu (jako je rakovina, autoimunitní onemocnění a chronická imunosupresivní léčba). Kontrolní skupina podstoupí CT srdce nebo koronarografii podle klinického podezření za účelem vyloučení ICHS a bez ohledu na protokol studie.

Vzorky krve. 10 ml žilní krve se odebere do zkumavek obsahujících ethylendiamintetraoctovou kyselinu (EDTA) a gel s aktivátorem sraženiny od zařazených pacientů všech účastníků studie. Koncentrace sérového kreatininu, troponinu, kreatinfosfokinázy (CPK), hemoglobinu, triglyceridů (TG), celkového cholesterolu (TC), lipoproteinů s vysokou hustotou (HDL), lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL), glukózy, c-reaktivního proteinu ( CRP), natriuretický peptid typu b (BNP) a hemoglobin A1c (HbA1C) budou měřeny automatickým biochemickým analyzátorem.

Kromě toho budou hladiny TMAO měřeny z krevní plazmy pomocí ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie - hmotnostní spektrometrie - monitorování vícenásobné reakce (UHPLC-MS/MRM), jak bylo popsáno výše.

Nutriční profilování. Všichni účastníci nahlásí své zvyky v konzumaci potravin vyplněním dotazníku o frekvenci jídla (FFQ).

Srdeční CT analýza. Vybraní účastníci podstoupí CT angiografii pro hodnocení a kvantifikaci CAD pomocí systému 256 řezů (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Data budou získávána s kolimací 96 x 0,625 mm a dobou rotace gantry 330 ms. Intravenózní injekce 60 až 90 ml neiontové kontrastní látky při průtoku 5 ml/s bude následovat 30ml fyziologický roztok chase bolus (3 ml/s). Akvizice bude prováděna během inspirační zádrže dechu, zatímco elektrokardiogram bude zaznamenáván současně, aby bylo v závislosti na srdeční frekvenci umožněno retrospektivní nebo prospektivní hradlování dat. Všechny snímky budou rekonstruovány s tloušťkou řezu 0,67 mm a přírůstkem řezu 0,34 mm. Kompletní datová sada bude přenesena na vyhrazenou CT pracovní stanici s 3-rozměrným rekonstrukčním nástrojem speciálně navrženým pro koronární angiografii (Philips Intellispace Portal, verze 7.0), aby bylo možné provádět multiplanární reformace a kvantitativní analýzu plaku. Nezávislý čtenář přezkoumá všechny studie. Každá céva obsahující významnou stenózu bude analyzována na zakřivených multiplanárních přeformátovaných snímcích v podélných a příčných řezech. Budou měřeny průměry v místě maximální stenózy a v proximálních a distálních referencích. Stupeň stenózy bude vypočítán jako poměr rozdílu mezi průměrem při maximální stenóze a průměrem průměrů v proximální a distální referenci dělený průměrem průměrů v proximální a distální referenci a vyjádřen v procentech. Index remodelace bude vypočítán jako vnější plocha cévy v místě maximální stenózy dělená průměrem oblastí vnějších cév v proximálních a distálních referencích. Pozitivní remodelace bude definována jako index remodelace ≥ 1,05. Objem plaku bude automaticky vypočítán jako objem všech voxelů segmentovaných mezi luminální a vnější hranicí cévy na zakřivených multiplanárních přeformátovaných snímcích. Proximální a distální reference budou použity jako proximální a distální konce plaků. Výzkumníci budou hlásit celkový objem plaku a objemy podtypů plaků: kalcifikované, nekalcifikované a smíšené plaky.

Srdeční katetrizace a perkutánní koronární intervence (PCI). Pacienti budou přijímáni do katetrizační laboratoře podle klinického obrazu s přihlédnutím k aktuálním klinickým doporučením ESC/AHA. Srdeční katetrizační procedura bude provedena pomocí standardních perkutánních technik přes a. radialis nebo femoralis. Koronární léze vyhodnotí operátor z hlediska stenózy vizuálním odhadem nebo jiným použitím objektivních měření, jako je kvantitativní koronární analýza (QCA). Koronární intervence, včetně balónkové angioplastiky a implantace stentu, bude provedena podle potřeby a podle závažnosti koronární stenózy, tj. (≥70% průměr stenózy). Doplňkové koronární zobrazení (OCT nebo intravaskulární ultrazvuk) bude provedeno podle uvážení operátora a bez ohledu na protokol studie. Všichni pacienti budou během procedury léčeni antikoagulací (většinou nefrakcionovaným heparinem) s pečlivým sledováním aktivovaného času srážení mezi 250-300 sekundami. Po angioplastice budou všichni pacienti léčeni duální protidestičkovou terapií kombinující aspirin a inhibitor P2Y12 (klopidogrel, prasugrel nebo tikagrelor, dle klinické indikace) po dobu 6-12 měsíců, pokud se nevyskytnou kontraindikace, např. léčba perorálními antikoagulancii.

Extrakce a filtrace genomové DNA. Genomická DNA ze vzorků stolice bude purifikována pomocí PowerMag Soil DNA izolační sady (MoBio) optimalizované pro automatizovanou platformu Tecan. Pro sekvenování pomocí brokovnice bude 100 ng purifikované DNA nastříháno pomocí sonikátoru Covaris E220X.

Analýza mikrobiomů. Vzorky mikrobiomu budou zpracovány automatizovaným robotickým potrubím v 96jamkovém formátu. Každá odebraná skupina vzorků bude zpracována roboticky pro 16S i metagenomické sekvenování.

Generování funkcí založených na mikrobiomu. Vyšetřovatelé použijí a dále rozšíří výpočetní potrubí, které bylo vyvinuto pro generování bohaté sady vlastností z metagenomického vzorku. Tyto vlastnosti budou základem pro modely, které identifikují podpisy založené na mikrobiomu.

Bakteriální a virové abundance - Mapování vzorku metagenomu do referenční databáze bakteriálního genomu a poté počítání počtu čtení mapujících na každou bakterii, což vede k vektoru relativního bakteriálního množství pro každý vzorek.

Bakteriální diverzita - Pomocí výše odvozených relativních bakteriálních četností výzkumníci spočítají několik měření diverzity bakterií a virů ve vzorku metagenomu (např. Shannonova entropie vektoru relativní četnosti, počet bakterií nad určitou minimální úrovní četnosti), jako Ukázalo se, že rozmanitost vzorků je spojena s určitými fyziologickými aspekty hostitele, jako je celková adipozita a inzulínová rezistence.

Rychlosti růstu bakterií - Pro každý vzorek metagenomu výzkumníci vypočítají vektor, který odpovídá rychlosti růstu každé bakterie ve vzorku, za použití nové metody, která byla nedávno vyvinuta pro tento účel. Stručně řečeno, zkoumáním vzoru sekvenování pokrytí čtením (hloubka) napříč délkou různých bakteriálních genomů výzkumníci zjistili, že mnoho bakterií vykazuje prototypický vzor pokrytí, který se skládá z jednoho dna a jediného vrcholu. Je pozoruhodné, že umístění píku se shoduje se známým počátkem replikace bakterií, což naznačuje, že přidané pokrytí čtení blízko píku představuje nově replikovanou DNA. U jakékoli dané bakterie se poměr mezi maximálním a minimálním pokrytím mezi vzorky z různých lidských střevních mikrobiomů velmi liší, přičemž vysoké poměry jsou podobné těm, které byly získány během exponenciální růstové fáze bakterií pěstovaných v kultuře, a nízké poměry jsou podobné růstu ve stacionárních podmínkách. fáze.

Četnost genů – Badatelé spočítají relativní četnost genů ve vzorcích metagenomu použitím podobného přístupu jako výše pro odvození relativních četností bakterií. Za tímto účelem, spíše než mapování čtení do referenční databáze bakteriálního genomu, je výzkumníci namapují do referenční databáze bakteriálních genů, která byla nedávno rozšířena a která společně obsahuje více než 3 miliony různých bakteriálních genů. Odvozené vektory četnosti genů jsou komplementární k vektorům četnosti bakterií, s výhodou je mapování na geny, jejichž zabudování bakteriálního genomu je neznámé, a tak umožňuje mapování více čtení sekvenování metagenomu, a s nevýhodou produkce mnohem většího charakteristického vektoru.

Abundance biologické dráhy – Jako další soubor vlastností, které poskytují informace na funkční úrovni mikrobioty, použijí výzkumníci KEGG databázi biologických drah51 a výše uvedený vektor genové abundance každého vzorku k výpočtu skóre abundance pro každou biologickou dráhu. Klíčovou výhodou této sady funkcí je to, že její asociace poskytují přímé hypotézy týkající se základních mechanismů, jejichž prostřednictvím může být mikrobiota zapojena do korelovaného fenotypu.

Uložení vzorků. Vzorky, stejně jako zbývající DNA a zmrazená séra budou skladovány v mrazicích boxech -80C. Nezpracované vzorky stolice (např. ne všechny vzorky odebrané ročně budou zpočátku zpracovány) budou také skladovány v mrazicích boxech -800C.

Statistická analýza. Klinické údaje, jako jsou vitální funkce, kardiovaskulární rizikové faktory (věk, pohlaví, lipidový profil, glykemický index, kouření, předchozí CAD), chronické komorbidity, pravidelné užívání léků, zobrazovací nálezy na srdečním CT a/nebo srdeční katetrizaci, stejně jako hladiny srdečních enzymů budou shromažďovány v Rabin Medical Center. Ve Weizmannově vědeckém institutu, v oddělení informatiky v laboratoři Segal, budou vyšetřovatelé analyzovat data. Pro každý parametr budou provedeny asociační analýzy k identifikaci všech parametrů mikrobiomu, které jsou spojeny s těmito klinickými parametry.

Po analýze signatur mikrobiomu u těch pacientů, u kterých mohou známé probiotické a/nebo nutriční intervence vést k požadované změně, zasáhnou výzkumníci a poté budou sledovat sekvenování mikrobiomu po intervenci.