Dient das menschliche Darmmikrobiom als neuartiges personalisiertes therapeutisches Ziel für koronare Atherosklerose?

Einführung:

Das menschliche Magen-Darm-System ist mit einer Vielzahl symbiotischer Mikroorganismen, den Mikrobiota, besiedelt. Sein Gesamtgewicht beträgt etwa 2 Kilogramm und enthält Billionen von Mikroorganismen. Das Mikrobiom ist die Gesamtheit der genetischen (metagenomischen) Daten der Mikrobiota. In den letzten Jahren hat die Entwicklung effizienter Methoden zur Genomsequenzierung und Bioinformatik eine schnelle und genaue Quantifizierung und Qualifizierung des Mikrobioms ermöglicht und die Mikrobiomanalyse zur führenden Methode der Mikrobiotaforschung gemacht.

Die koronare Herzkrankheit (KHK) ist weltweit für mehr als 8 Millionen Todesfälle pro Jahr verantwortlich. Insbesondere das akute Koronarsyndrom (ACS) ist nach wie vor eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität und ist in den Vereinigten Staaten jährlich für mehr als 1 Million Krankenhauseinweisungen verantwortlich. Das pathophysiologische Kennzeichen des ACS ist eine Koronarthrombose, die durch eine atherosklerotische Plaque-Verletzung verursacht wird, wobei zwei Arten von Verletzungen beschrieben werden. Zum einen handelt es sich um Plaque-Rupturen, die nach wie vor die häufigste Ursache einer koronaren Atherothrombose sind, zum anderen um oberflächliche Plaque-Erosionen, die immer häufiger erkannt werden. Im Gegensatz zu Plaque-Rupturen haben durch Erosion verursachte Läsionen keine dünnen Faserkappen, keine zahlreichen Entzündungszellen oder einen großen Lipidkern, sondern sind reich an extrazellulärer Matrix wie Proteoglykanen und Glykosaminoglykanen.

Bildgebende Untersuchungen wie die Koronar-Computertomographie-Angiographie (CCTA) und diagnostische Koronarkatheterisierungen mit oder ohne optische Kohärenztomographie (OCT) werden in der klinischen Praxis zunehmend eingesetzt, um den Mechanismus zu charakterisieren, der für instabile/anfällige atherosklerotische Plaques verantwortlich ist.

Die menschliche Darmmikrobiota interagiert intensiv mit dem Wirt durch metabolischen Austausch und Co-Metabolismus von Substraten; Dadurch tragen sie zu einer Vielzahl metabolischer und immunologischer Mechanismen im menschlichen Körper bei. CAD ist ein wichtiges Interessengebiet in der Mikrobiota-Forschung, und es gibt mehrere Erkenntnisse, die die Darmmikrobiota mit der Pathophysiologie von CAD in Verbindung bringen. Erstens wurde Mikrobiota mit dem metabolischen Syndrom in Verbindung gebracht, nämlich Fettleibigkeit und Insulinresistenz. Es wird vermutet, dass die Darmmikrobiota die Produktion kurzkettiger Fettsäuren erhöhen kann, was schließlich den Appetit steigert und so Fettleibigkeit verursacht. Eine andere Hypothese besagt, dass Endotoxine der Darmmikrobiota in den Blutkreislauf gelangen und eine Entzündungskaskade auslösen können, die schließlich Arteriosklerose fördert. Zweitens könnte die Mikrobiota auch eine Rolle bei der Entstehung von Arteriosklerose spielen. Bei Patienten mit symptomatischer Atherosklerose gibt es ein einzigartiges Mikrobiommuster, das möglicherweise entzündungsfördernde Eigenschaften aufweist. Kürzlich wurde bei Patienten mit hohem kardiovaskulären Risikoprofil ein einzigartiges mikrobielles Muster festgestellt. Drittens metabolisieren Darmmikrobiota Phosphatidylcholin (Lecitin) aus der Nahrung, um den Metaboliten Trimethylamin-N-oxid (TMAO) zu produzieren, der mit einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse verbunden ist.

Die bisher veröffentlichten Daten beziehen sich ausschließlich auf die Interaktion zwischen dem menschlichen Darmmikrobiom und kardiovaskulären Risikofaktoren. Nach bestem Wissen und Verständnis des Forschers fehlt die Mikrobiomanalyse von Patienten mit einer gesicherten Diagnose von CAD (einschließlich ACS).

Ziele:

Der Zweck der aktuellen Studie besteht darin, die Darmmikrobiota von Patienten mit symptomatischer CAD zu untersuchen, sowohl in stabilen als auch in akuten Phasen. Die Forscher gehen davon aus, dass die Studienteilnehmer über eine einzigartige Mikrobiomsignatur verfügen würden, die einen neuen Einblick in die Pathophysiologie der atherosklerotischen CAD bieten und gleichzeitig mutmaßliche therapeutische Implikationen bieten könnte.

Nachdem die einzigartige Mikrobiomsignatur in einer großen Kohorte von CAD-Patienten ermittelt worden war, korrelierten die Forscher sie mit den TMAO-Werten, um deren Rolle in der Pathophysiologie von CAD weiter zu untersuchen. In der letzten Phase würden die Forscher versuchen, Möglichkeiten zu finden, personalisierte Behandlungsoptionen anzupassen, um die „proatherosklerotische“ Darmmikrobiota zu verändern. Durch die Verwendung von Daten aus der aktuellen Studie mit der früheren 1000-Patienten-Kohorte der Forscher mit bekanntem Mikrobiom und Ernährungsprofil wäre es möglich, nach einem spezifischen Ziel für Ernährungsinterventionen wie Probiotika zu suchen. Anschließend würden die Forscher die Patienten mit Sequenzierung des Mikrobioms nach der Ernährungsintervention überwachen.

Methoden:

Studiendesign und Rekrutierung. An der Studie nehmen Patienten im Alter von 30 bis 80 Jahren teil, die mit Verdacht auf koronare Herzkrankheit im Rabin Medical Center eintreffen und eine Einverständniserklärung abgeben können. Die Teilnehmer stellen Fragebögen zu Medizin, Lebensstil und Ernährung zur Verfügung. Während des Krankenhausaufenthaltes werden Blutdruck- und Herzfrequenzmessungen sowie Bluttests und Stuhlproben und/oder Rektalabstriche durchgeführt. Um den Verdacht auf eine atherosklerotische Erkrankung zu beurteilen und/oder zu behandeln, werden sich die Teilnehmer einer Herz-CT und/oder einer Herzkatheterisierung gemäß dem Pflegestandard und auf der Grundlage der Entscheidung des behandelnden Kardiologen unterziehen. Diagnose- und Behandlungsoptionen basieren ausschließlich auf dem Gesundheitszustand der Teilnehmer und unabhängig vom oben genannten Studienprotokoll.

Die Kontrollgruppe wird so ausgewählt, dass sie eine auf Alter, Geschlecht und kardiovaskuläre Risikofaktoren abgestimmte Gruppe ohne aktuelle CAD darstellt. Weitere Ausschlusskriterien in der Kontrollgruppe sind der Antibiotikakonsum in den folgenden 3 Monaten, eine entzündliche Darmerkrankung oder eine andere signifikante chronische Erkrankung, die die Mikrobiota beeinflussen kann (z. B. Krebs, Autoimmunerkrankung und chronische immunsuppressive Behandlung). Die Kontrollgruppe wird je nach klinischem Verdacht einer Herz-CT oder Koronarangiographie unterzogen, um eine koronare Herzkrankheit auszuschließen, und zwar unabhängig vom Studienprotokoll.

Blutproben. Von den eingeschriebenen Patienten aller Studienteilnehmer werden 10 ml venöses Blut in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Gel mit Gerinnungsaktivator enthaltenden Röhrchen gesammelt. Die Konzentrationen von Serumkreatinin, Troponin, Kreatinphosphokinase (CPK), Hämoglobin, Triglyceriden (TG), Gesamtcholesterin (TC), Lipoproteinen hoher Dichte (HDL), Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL), Glukose und c-reaktivem Protein ( CRP), natriuretisches Peptid vom B-Typ (BNP) und Hämoglobin A1c (HbA1C) werden mit einem automatischen biochemischen Analysegerät gemessen.

Darüber hinaus werden die TMAO-Spiegel im Blutplasma mithilfe der Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie – Massenspektrometrie – Mehrfachreaktionsüberwachung (UHPLC-MS/MRM) wie zuvor beschrieben gemessen.

Ernährungsprofilierung. Alle Teilnehmer melden ihre Gewohnheiten beim Lebensmittelkonsum, indem sie den Food Frequency Questionnaire (FFQ) ausfüllen.

Herz-CT-Analyse. Ausgewählte Teilnehmer werden einer CT-Angiographie zur Bewertung und Quantifizierung von CAD unter Verwendung eines 256-Schicht-Systems (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio) unterzogen. Die Daten werden mit einer Kollimation von 96 x 0,625 mm und einer Gantry-Rotationszeit von 330 ms erfasst. Auf die intravenöse Injektion von 60 bis 90 ml nichtionischem Kontrastmittel mit einer Flussrate von 5 ml/s folgt ein 30 ml Kochsalzlösungsbolus (3 ml/s). Die Erfassung erfolgt während eines inspiratorischen Atemanhaltens, während gleichzeitig das Elektrokardiogramm aufgezeichnet wird, um abhängig von der Herzfrequenz eine retrospektive oder prospektive Gating-Analyse der Daten zu ermöglichen. Alle Bilder werden mit einer Schichtdicke von 0,67 mm und einem Schichtinkrement von 0,34 mm rekonstruiert. Der vollständige Datensatz wird an eine spezielle CT-Workstation mit einem dreidimensionalen Rekonstruktionstool übertragen, das speziell für die Koronarangiographie entwickelt wurde (Philips Intellispace Portal, Version 7.0), um multiplanare Reformationen und quantitative Plaqueanalysen zu ermöglichen. Alle Studien werden von einem unabhängigen Gutachter begutachtet. Jedes Gefäß, das eine signifikante Stenose enthält, wird in gekrümmten, multiplanaren, neu formatierten Bildern in Längsachsen- und Querschnittsansichten analysiert. Es werden Durchmesser an der Stelle maximaler Stenose sowie an proximalen und distalen Referenzen gemessen. Der Stenosegrad wird als Verhältnis der Differenz zwischen dem Durchmesser bei maximaler Stenose und dem Mittelwert der Durchmesser an den proximalen und distalen Referenzen, dividiert durch den Mittelwert der Durchmesser an den proximalen und distalen Referenzen, berechnet und als Prozentsatz ausgedrückt. Der Remodellierungsindex wird als äußere Gefäßfläche an der Stelle der maximalen Stenose dividiert durch den Mittelwert der äußeren Gefäßflächen an proximalen und distalen Referenzpunkten berechnet. Positiver Umbau wird als Umbauindex ≥ 1,05 definiert. Das Plaquevolumen wird automatisch als Volumen aller Voxel berechnet, die zwischen den luminalen und äußeren Gefäßgrenzen auf gekrümmten, multiplanaren, neu formatierten Bildern segmentiert sind. Als proximale und distale Enden der Plaques werden proximale und distale Referenzen verwendet. Die Forscher werden das Gesamtvolumen der Plaque und die Volumina der Plaque-Subtypen angeben: verkalkte, nicht verkalkte und gemischte Plaques.

Herzkatheterisierung und perkutane Koronarintervention (PCI). Die Aufnahme in das Katheterisierungslabor erfolgt entsprechend ihrem klinischen Erscheinungsbild unter Berücksichtigung der aktuellen klinischen ESC/AHA-Richtlinien. Die Herzkatheterisierung wird mit standardmäßigen perkutanen Techniken über die Arteria radialis oder die Arteria femoralis durchgeführt. Koronarläsionen werden vom Bediener im Hinblick auf Stenose durch visuelle Schätzung oder andere objektive Messungen, wie z. B. quantitative Koronaranalyse (QCA), bewertet. Koronarinterventionen, einschließlich Ballonangioplastie und Stentimplantation, werden nach Bedarf und entsprechend der Schwere der Koronarstenose, d. h. (Stenose ≥ 70 % Durchmesser), durchgeführt. Eine ergänzende koronare Bildgebung (OCT oder intravaskulärer Ultraschall) wird nach Ermessen des Bedieners und unabhängig vom Studienprotokoll durchgeführt. Alle Patienten werden während des Eingriffs mit Antikoagulationsmitteln (meist unfraktioniertes Heparin) behandelt, wobei die aktivierte Gerinnungszeit zwischen 250 und 300 Sekunden sorgfältig überwacht wird. Nach dem Angioplastie-Eingriff werden alle Patienten 6–12 Monate lang mit einer dualen Thrombozytenaggregationshemmer-Therapie in Kombination mit Aspirin und P2Y12-Inhibitor (Clopidogrel, Prasugrel oder Ticagrelor, je nach klinischer Indikation) behandelt, sofern keine Kontraindikation vorliegt, wie z Behandlung mit oralen Antikoagulanzien.

Extraktion und Filterung genomischer DNA. Genomische DNA aus Stuhlproben wird mit dem PowerMag Soil DNA Isolation Kit (MoBio) gereinigt, das für die automatisierte Tecan-Plattform optimiert ist. Für die Shotgun-Sequenzierung werden 100 ng gereinigte DNA mit einem Covaris E220X-Ultraschallgerät geschert.

Mikrobiomanalyse. Mikrobiomproben werden von einer automatisierten Roboterpipeline im 96-Well-Format verarbeitet. Jede gesammelte Probengruppe wird robotergesteuert sowohl für die 16S- als auch für die metagenomische Sequenzierung verarbeitet.

Generierung mikrobiombasierter Funktionen. Die Forscher werden eine Rechenpipeline einsetzen und weiter ausbauen, die für die Generierung einer Vielzahl von Merkmalen aus einer metagenomischen Probe entwickelt wurde. Diese Merkmale werden die Grundlage für Modelle bilden, die mikrobiombasierte Signaturen identifizieren.

Bakterien- und Virushäufigkeiten – Zuordnung der Metagenomprobe zu einer Referenz-Bakteriengenomdatenbank und anschließendes Zählen der Anzahl der Lesevorgänge, die jedem Bakterium zugeordnet sind, was zu einem Vektor der relativen Bakterienhäufigkeit für jede Probe führt.

Bakterienvielfalt – Anhand der oben abgeleiteten relativen Bakterienhäufigkeit werden die Forscher mehrere Maße für die Diversität von Bakterien und Viren in einer Metagenomprobe berechnen (z. B. Shannon-Entropie des relativen Häufigkeitsvektors, Anzahl der Bakterien über einem Mindesthäufigkeitsniveau), wie z Es wurde gezeigt, dass die Probenvielfalt mit bestimmten physiologischen Aspekten des Wirts zusammenhängt, wie etwa der allgemeinen Adipositas und der Insulinresistenz.

Bakterienwachstumsraten – Für jede Metagenomprobe berechnen die Forscher einen Vektor, der der Wachstumsrate jedes Bakteriums in der Probe entspricht, und verwenden dabei eine neuartige Methode, die kürzlich für diesen Zweck entwickelt wurde. Kurz gesagt: Durch die Untersuchung des Musters der Leseabdeckung (Tiefe) der Sequenzierung über die Länge verschiedener Bakteriengenome fanden die Forscher heraus, dass viele Bakterien ein prototypisches Abdeckungsmuster aufweisen, das aus einem einzelnen Tiefpunkt und einem einzelnen Peak besteht. Bemerkenswert ist, dass die Position des Peaks mit dem bekannten Replikationsursprung der Bakterien übereinstimmt, was darauf hindeutet, dass die zusätzliche Leseabdeckung in der Nähe des Peaks neu replizierte DNA darstellt. Für jedes bestimmte Bakterium variiert das Verhältnis zwischen Spitzen- und Tiefstbedeckung stark zwischen Proben aus verschiedenen menschlichen Darmmikrobiomen, wobei hohe Verhältnisse denen ähneln, die während der exponentiellen Wachstumsphase von in Kultur gezüchteten Bakterien erhalten werden, und niedrige Verhältnisse dem Wachstum in stationären Bakterien ähneln Phase.

Genhäufigkeit – Die Forscher werden die relative Häufigkeit von Genen in Metagenomproben berechnen, indem sie einen ähnlichen Ansatz wie oben anwenden, um die relative Häufigkeit von Bakterien abzuleiten. Zu diesem Zweck werden die Forscher die Lesevorgänge nicht der Referenz-Bakteriengenomdatenbank zuordnen, sondern sie einer Referenzdatenbank mit Bakteriengenen zuordnen, die kürzlich erweitert wurde und insgesamt über 3 Millionen verschiedene Bakteriengene enthält. Die abgeleiteten Genhäufigkeitsvektoren sind komplementär zu den Bakterienhäufigkeitsvektoren. Der Vorteil besteht darin, dass sie auf Gene abgebildet werden, deren eingebettetes Bakteriengenom unbekannt ist, sodass mehr Metagenomsequenzierungslesungen kartiert werden können. Der Nachteil besteht jedoch darin, dass ein viel größerer Merkmalsvektor entsteht.

Abundanzen biologischer Signalwege – Als weiteren Satz von Merkmalen, die Informationen auf der Funktionsebene der Mikrobiota liefern, werden die Forscher die KEGG-Datenbank biologischer Signalwege51 und den oben genannten Vektor der Genhäufigkeit jeder Probe verwenden, um einen Häufigkeitswert für jeden biologischen Signalweg zu berechnen. Der Hauptvorteil dieser Reihe von Merkmalen besteht darin, dass ihre Assoziationen direkte Hypothesen über die zugrunde liegenden Mechanismen liefern, durch die die Mikrobiota am korrelierten Phänotyp beteiligt sein könnte.

Probenlagerung. Die Proben sowie verbleibende DNA und gefrorene Seren werden in Gefrierschränken mit -80 °C gelagert. Unverarbeitete Stuhlproben (z. B. werden zunächst nicht alle jährlich gesammelten Proben verarbeitet) werden ebenfalls in Gefrierschränken mit -80 °C gelagert.

Statistische Analyse. Klinische Daten wie Vitalzeichen, kardiovaskuläre Risikofaktoren (Alter, Geschlecht, Lipidprofil, glykämischer Index, Raucherstatus, frühere KHK), chronische Komorbiditäten, regelmäßiger Drogenkonsum, bildgebende Befunde bei Herz-CT und/oder Herzkatheterisierung sowie Herzenzymwerte werden im Rabin Medical Center erhoben. Am Weizmann Institute of Science, in der Informatikabteilung des Segal Lab, werden die Forscher die Daten analysieren. Für jeden Parameter wird eine Assoziationsanalyse durchgeführt, um alle Mikrobiomparameter zu identifizieren, die mit diesen klinischen Parametern assoziiert sind.

Nach der Analyse der Mikrobiomsignaturen bei Patienten, bei denen bekannte probiotische und/oder ernährungsphysiologische Eingriffe zu der gewünschten Veränderung führen können, greifen die Forscher ein und überwachen das Mikrobiom nach dem Eingriff mit der Sequenzierung.