Fungerar den mänskliga tarmmikrobiomet som ett nytt personligt terapeutiskt mål för koronar ateroskleros?

Introduktion:

Det mänskliga gastrointestinala systemet är befolkat med en mängd olika symbiotiska mikroorganismer, nämligen mikrobiota. Dess totala vikt är cirka 2 kg och innehåller biljoner mikroorganismer. Mikrobiomet är den totala genetiska (metagenomiska) data för mikrobiotan. Under de senaste åren har utvecklingen av effektiva metoder för genomsekvensering och bioinformatik möjliggjort snabb och korrekt kvantifiering och kvalificering av mikrobiomet, vilket gjort mikrobiomanalys till ledande metod för mikrobiotaforskning.

Kranskärlssjukdom (CAD) stod för mer än 8 miljoner dödsfall årligen över hela världen. I synnerhet är akut kranskärlssyndrom (ACS) fortfarande en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet och är ansvarig för mer än 1 miljon sjukhusinläggningar i USA årligen. Det patofysiologiska kännetecknet för ACS är koronar trombos orsakad av aterosklerotisk plackskada, med två typer av skador som beskrivs. Den första är plackruptur, som fortfarande är den vanligaste orsaken till koronar aterotrombos, och den andra är ytlig plackerosion som upptäcks med ökande frekvens. I motsats till plackruptur har lesioner som orsakas av erosion inte tunna fibrösa lock, rikliga inflammatoriska celler eller en stor lipidkärna, utan snarare rik på extracellulär matris, såsom proteoglykaner och glykosaminoglykaner.

Avbildningsstudier som kranskärlsdatortomografisk angiografi (CCTA) och diagnostiska koronarkateteriseringar med eller utan optisk koherenstomografi (OCT) används alltmer i klinisk praxis för att karakterisera mekanismen som är ansvarig för instabil/sårbar aterosklerotisk plack.

Den mänskliga tarmmikrobiotan interagerar i stor utsträckning med värden genom metaboliskt utbyte och sammetabolism av substrat; bidrar därigenom till en mängd olika metaboliska och immunologiska mekanismer i människokroppen. CAD är ett stort intresseområde inom mikrobiotaforskning, och det har gjorts flera fynd som kopplar tarmmikrobiotan till CAD-patofysiologi. För det första var mikrobiota associerad med metabolt syndrom, nämligen fetma och insulinresistens. Det antas att tarmmikrobiota kan öka kortkedjiga fettsyror, som så småningom ökar aptiten och därmed orsaka fetma. En annan hypotes är att endotoxiner från tarmmikrobiota kan translokera till blodomloppet, framkalla inflammatorisk kaskad som så småningom främjar åderförkalkning. För det andra kan mikrobiota också ha en roll i utvecklingen av ateroskleros. Hos patienter med symtomatisk åderförkalkning finns det ett unikt mikrobiommönster som kan ha pro-inflammatoriska egenskaper. Nyligen hittades ett unikt mikrobiellt mönster bland patienter med hög kardiovaskulär riskprofil. För det tredje metaboliserar tarmmikrobiota fosfatidylkolin (lecitin) i kosten för att producera metaboliten trimetylamin-N-oxid (TMAO), som är associerad med ökad risk för kardiovaskulära händelser.

De data som hittills publicerats avser enbart interaktionen mellan människans tarmmikrobiom och kardiovaskulära riskfaktorer. Så vitt utredaren vet och förstår saknas mikrobiomanalysen av patienter med en fastställd diagnos av CAD (inklusive ACS).

Mål:

Syftet med den aktuella studien är att undersöka tarmmikrobiotan hos patienter med symptomatisk CAD, både i stabila och under akuta faser. Utredarna antar att studiedeltagarna skulle presentera en unik mikrobiomsignatur som kan ge en ny insikt i patofysiologin för aterosklerotisk CAD samtidigt som de ger förmodade terapeutiska implikationer.

Efter att ha etablerat den unika mikrobiomsignaturen i en stor kohort av CAD-patienter, skulle utredarna korrelera den till TMAO-nivåer för att ytterligare undersöka dess del i patofysiologin för CAD. I slutskedet skulle utredarna försöka hitta sätt att justera personliga behandlingsalternativ för att förändra den "pro-aterosklerotiska" tarmmikrobiotan. Genom att använda data från den aktuella studien med utredarnas tidigare 1000 patientkohort med känd mikrobiom och näringsprofil, skulle den kunna söka efter ett specifikt mål för näringsintervention, såsom probiotika. Sedan skulle utredarna övervaka patienterna med sekvensering av mikrobiomet efter näringsinterventionen.

Metoder:

Studiedesign och rekrytering. Studiedeltagare kommer att vara patienter i åldern 30-80 som anländer till Rabin Medical Center med misstänkt CAD och kan ge informerat samtycke. Deltagarna kommer att tillhandahålla medicinska, livsstils- och näringsfrågor. Blodtrycks- och hjärtfrekvensmätningar kommer att tas under sjukhusvistelse samt blodprover och avföringsprover och/eller ändtarmsprover. För att utvärdera och/eller behandla misstänkt aterosklerotisk sjukdom kommer deltagarna att genomgå hjärt-CT och/eller hjärtkateterisering i enlighet med vårdstandarden och baserat på den behandlande kardiologens beslut. Diagnostik och behandlingsalternativ kommer endast att baseras på deltagarnas medicinska tillstånd och oavsett det ovan nämnda studieprotokollet.

Kontrollgruppen kommer att väljas för att representera en grupp som matchar ålder, kön och kardiovaskulära riskfaktorer utan nuvarande CAD. Ytterligare uteslutningskriterier i kontrollgruppen kommer att vara antibiotikakonsumtion under de följande 3 månaderna, inflammatorisk tarmsjukdom eller annan signifikant kronisk sjukdom som kan påverka mikrobiotan (såsom cancer, autoimmun sjukdom och kronisk immunsuppressiv behandling). Kontrollgruppen kommer att genomgå hjärt-CT eller koronar angiografi enligt klinisk misstanke för att utesluta CAD och oavsett studieprotokoll.

Blodprover. 10 ml venöst blod kommer att samlas in i etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och gel med rör som innehåller proppaktivator från de inskrivna patienterna i alla studiedeltagare. Koncentrationerna av serumkreatinin, troponin, kreatinfosfokinas (CPK), hemoglobin, triglycerider (TG), totalkolesterol (TC), högdensitetslipoproteiner (HDL), lågdensitetslipoproteiner (LDL), glukos, c-reaktivt protein ( CRP), b-typ natriuretisk peptid (BNP) och hemoglobin A1c (HbA1C) kommer att mätas med automatisk biokemianalysator.

Dessutom kommer nivåerna av TMAO att mätas från blodplasma genom att använda Ultra-High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometric - Multiple Reaction Monitoring (UHPLC-MS/MRM) som tidigare beskrivits.

Näringsprofilering. Alla deltagare kommer att rapportera sina vanor av matkonsumtion genom att fylla i Food Frequency Questionnaire (FFQ).

Hjärt-CT-analys. Utvalda deltagare kommer att genomgå CT-angiografi för utvärdering och kvantifiering av CAD med hjälp av ett 256-slice-system (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Data kommer att inhämtas med en kollimering på 96 X 0,625 mm och en portalrotationstid på 330 ms. Intravenös injektion av 60 till 90 ml nonjoniskt kontrastmedel med en flödeshastighet på 5 ml/s kommer att följas av en 30 ml saltlösnings bolus (3 ml/s). Insamlingen kommer att utföras under ett andningsuppehåll medan elektrokardiogrammet kommer att spelas in samtidigt för att, beroende på hjärtfrekvensen, tillåta retrospektiv eller prospektiv gating av data. Alla bilder kommer att rekonstrueras med en skivtjocklek på 0,67 mm och ett segmentsteg på 0,34 mm. Den fullständiga datamängden kommer att överföras till en dedikerad CT-arbetsstation med ett 3-dimensionellt rekonstruktionsverktyg speciellt utformat för kranskärlsangiografi (Philips Intellispace Portal, version 7.0) för att möjliggöra multiplanära reformeringar och kvantitativ plackanalys. En oberoende läsare kommer att granska alla studier. Varje kärl som innehåller signifikant stenos kommer att analyseras i böjda flerplansformaterade bilder i långaxel- och tvärsnittsvyer. Diametrar vid platsen för maximal stenos och vid proximala och distala referenser kommer att mätas. Graden av stenos kommer att beräknas som förhållandet mellan skillnaden mellan diametern vid maximal stenos och medelvärdet av diametrarna vid de proximala och distala referenserna dividerat med medelvärdet av diametrarna vid proximala och distala referenser och uttryckt i procent. Remodelleringsindex kommer att beräknas som den yttre kärlarean vid platsen för maximal stenos dividerad med medelvärdet av ytterkärlsareor vid proximala och distala referenser. Positiv ombyggnad kommer att definieras som ett ombyggnadsindex ≥ 1,05. Plackvolym kommer automatiskt att beräknas som volymen av alla voxlar segmenterade mellan de luminala och yttre kärlgränserna på böjda flerplansformaterade bilder. Proximala och distala referenser kommer att användas som de proximala och distala ändarna av placken. Utredarna kommer att rapportera den totala volymen av plack och volymerna av placksubtyper: förkalkade, icke-förkalkade och blandade plack.

Hjärtkateterisering och perkutan kranskärlsintervention (PCI). Patienter kommer att läggas in på kateteriseringslaboratoriet enligt deras kliniska presentation, med beaktande av gällande ESC/AHA kliniska riktlinjer. Hjärtkateteriseringsproceduren kommer att utföras med vanliga perkutana tekniker via den radiella eller femorala artären. Koronarskador kommer att utvärderas av operatören i termer av stenos genom visuell uppskattning eller annat med hjälp av objektiva mätningar, såsom kvantitativ koronaranalys (QCA). Kranskärlsintervention, inklusive ballongangioplastik och stentimplantation, kommer att implementeras vid behov och i enlighet med svårighetsgraden av koronarstenos, dvs. (≥70 % diameter stenos). Tilläggsavbildning av kranskärlen (OCT eller intravaskulärt ultraljud) kommer att utföras enligt operatörens bedömning och oavsett studieprotokoll. Alla patienter kommer att behandlas under proceduren med antikoagulering (mest ofraktionerat heparin) med noggrann övervakning av aktiverad koagulationstid mellan 250-300 sekunder. Efter angioplastikingreppet kommer alla patienter att behandlas med dubbel trombocythämmande behandling som kombinerar acetylsalicylsyra och P2Y12-hämmare (klopidogrel, prasugrel eller ticagrelor, enligt den kliniska indikationen) i 6-12 månader, såvida det inte finns kontraindikationer, som t.ex. behandling med orala antikoagulantia.

Genomisk DNA-extraktion och filtrering. Genomiskt DNA från avföringsprover kommer att renas med hjälp av PowerMag Soil DNA-isoleringskit (MoBio) optimerat för Tecans automatiserade plattform. För hagelgevärssekvensering kommer 100 ng renat DNA att klippas med en Covaris E220X sonikator.

Mikrobiomanalys. Mikrobiomprover kommer att behandlas av en automatiserad robotpipeline i 96-brunnars format. Varje provgrupp som samlas in kommer att bearbetas robotiskt för både 16S och metagenomisk sekvensering.

Genererar mikrobiom-baserade funktioner. Utredarna kommer att använda och utöka en beräkningspipeline som utvecklades för att generera en rik uppsättning funktioner från ett metagenomiskt prov. Dessa egenskaper kommer att ligga till grund för modeller som identifierar mikrobiombaserade signaturer.

Bakterie- och virusöverflöd - Kartlägga metagenomprovet till en referensbakteriegenomdatabas och sedan räkna antalet läsningar som kartläggs till varje bakterie, vilket resulterar i en vektor av relativ bakteriell mängd för varje prov.

Bakteriell mångfald - Med hjälp av de relativa bakteriemängderna härledda ovan kommer utredarna att beräkna flera mått på mångfalden av bakterier och virus i ett metagenomprov (t.ex. Shannon-entropi av den relativa överflödsvektorn, antalet bakterier över någon minimal förekomstnivå), som provmångfald visade sig vara associerad med vissa fysiologiska aspekter av värden såsom övergripande fetthalt och insulinresistens.

Bakterietillväxthastigheter - För varje metagenomprov kommer utredarna att beräkna en vektor som motsvarar tillväxthastigheten för varje bakterie i provet, med hjälp av en ny metod som nyligen utvecklats för detta ändamål. Kortfattat, genom att undersöka mönstret för sekvensering av läst täckning (djup) över längden av olika bakteriegenom, fann forskarna att många bakterier uppvisar ett prototypiskt täckningsmönster, bestående av ett enda dal och en enda topp. Noterbart sammanfaller platsen för toppen med bakteriernas kända replikationsursprung, vilket tyder på att den extra lästäckningen nära toppen representerar nyreplicerat DNA. För en given bakterie varierar förhållandet mellan topp- och daltäckningen mycket mellan prover från olika mänskliga tarmmikrobiomer, med höga förhållanden som liknar de som erhålls under exponentiell tillväxtfas för bakterier som odlats i kultur, och låga förhållanden liknar tillväxt i stationära bakterier. fas.

Genförekomster - Utredarna kommer att beräkna den relativa förekomsten av gener i metagenomprover genom att tillämpa ett liknande tillvägagångssätt som ovan för att härleda relativa förekomster av bakterier. För detta ändamål, snarare än att kartlägga läsningarna till referensen av bakteriegenomdatabasen, kommer forskarna att mappa dem till en referensdatabas med bakteriegener som nyligen utökades och som tillsammans innehåller över 3 miljoner distinkta bakteriegener. De härledda genöverflödsvektorerna är komplementära till bakterieöverflödsvektorerna, med fördelen att kartläggas till gener vars inbäddade bakteriegenom är okänt och sålunda tillåter fler metagenomsekvensläsningar att kartläggas, och med nackdelen att producera en mycket större egenskapsvektor.

Förekomster av biologiska vägar - Som en annan uppsättning funktioner som ger information på mikrobiotans funktionella nivå, kommer forskarna att använda KEGG-databasen över biologiska vägar51 och vektorn ovan för genförekomst av varje prov för att beräkna ett överflödspoäng för varje biologisk väg. Den viktigaste fördelen med denna uppsättning funktioner är att dess associationer ger direkta hypoteser om de underliggande mekanismerna genom vilka mikrobiotan kan vara involverad i den korrelerade fenotypen.

Provförvaring. Proverna samt kvarvarande DNA och frysta serum kommer att förvaras i -80C frysar. Obearbetade avföringsprover (t.ex. kommer inte alla prover som samlas in årligen att behandlas initialt) kommer också att lagras i -800C frysar.

Statistisk analys. Kliniska data såsom vitala tecken, kardiovaskulära riskfaktorer (ålder, kön, lipidprofil, glykemiskt index, rökstatus, tidigare CAD), kroniska komorbiditeter, regelbunden läkemedelsanvändning, bildröntgen vid hjärt-CT och/eller hjärtkateterisering samt Hjärtenzymnivåer kommer att samlas in vid Rabin Medical Center. Vid Weizmann Institute of Science, i datavetenskapsavdelningen vid Segal Lab, kommer utredarna att analysera data. För varje parameter kommer en associationsanalys att utföras för att identifiera alla mikrobiomparametrar som är associerade med dessa kliniska parametrar.

Efter att ha analyserat mikrobiomens signaturer hos de patienter där kända probiotiska och/eller näringsingrepp kan leda till den önskade förändringen kommer utredarna att ingripa och sedan övervaka med sekvensering av mikrobiomet efter interventionen.