Il microbioma intestinale umano funge da nuovo bersaglio terapeutico personalizzato per l'aterosclerosi coronarica?

Introduzione:

Il sistema gastrointestinale umano è popolato da una varietà di microrganismi simbiotici, vale a dire il microbiota. Il suo peso totale è di circa 2 chilogrammi e contiene trilioni di microrganismi. Il microbioma è l'insieme dei dati genetici (metagenomici) del microbiota. Negli ultimi anni, lo sviluppo di metodi efficienti per il sequenziamento del genoma e la bioinformatica ha consentito una quantificazione e una qualificazione rapide e accurate del microbioma, rendendo l'analisi del microbioma il metodo principale della ricerca sul microbioma.

La malattia coronarica (CAD) è responsabile di oltre 8 milioni di morti ogni anno in tutto il mondo. In particolare, la sindrome coronarica acuta (ACS) rimane una delle principali cause di morbilità e mortalità ed è responsabile di oltre 1 milione di ricoveri ospedalieri negli Stati Uniti ogni anno. La caratteristica fisiopatologica dell'ACS è la trombosi coronarica causata dalla lesione della placca aterosclerotica, con due tipi di lesioni descritte. Il primo è la rottura della placca, che rimane la causa più comune di aterotrombosi coronarica, e il secondo è l'erosione superficiale della placca che viene riconosciuta con sempre maggiore frequenza. A differenza della rottura della placca, le lesioni causate dall'erosione non hanno cappucci fibrosi sottili, abbondanti cellule infiammatorie o un grande nucleo lipidico, ma piuttosto ricche di matrice extracellulare, come proteoglicani e glicosaminoglicani.

Gli studi di imaging come l'angiografia tomografica computerizzata coronarica (CCTA) e le cateterizzazioni coronariche diagnostiche con o senza tomografia a coerenza ottica (OCT) sono sempre più utilizzati nella pratica clinica per caratterizzare il meccanismo responsabile della placca aterosclerotica instabile/vulnerabile.

Il microbiota intestinale umano interagisce ampiamente con l'ospite attraverso lo scambio metabolico e il co-metabolismo dei substrati; contribuiscono così a una varietà di meccanismi metabolici e immunologici nel corpo umano. La CAD è un importante campo di interesse nella ricerca sul microbiota e ci sono state diverse scoperte che collegano il microbiota intestinale alla fisiopatologia della CAD. In primo luogo, il microbiota è stato associato alla sindrome metabolica, vale a dire l'obesità e l'insulino-resistenza. Si ipotizza che il microbiota intestinale possa aumentare gli acidi grassi a catena corta, che alla fine aumentano l'appetito, causando così l'obesità. Un'altra ipotesi è che le endotossine del microbiota intestinale possano traslocare nel flusso sanguigno, provocando una cascata infiammatoria che alla fine promuove l'aterosclerosi. In secondo luogo, il microbiota può anche avere un ruolo nello sviluppo dell'aterosclerosi. Nei pazienti con aterosclerosi sintomatica, esiste un modello di microbioma unico che può avere caratteristiche pro-infiammatorie. Recentemente, è stato trovato un modello microbico unico tra i pazienti con un alto profilo di rischio cardiovascolare. In terzo luogo, il microbiota intestinale metabolizza la fosfatidilcolina alimentare (lecitina) per produrre il metabolita trimetilammina-N-ossido (TMAO), che è associato ad un aumentato rischio di eventi cardiovascolari.

I dati pubblicati finora si riferiscono esclusivamente all'interazione tra microbioma intestinale umano e fattori di rischio cardiovascolare. Per quanto a conoscenza e comprensione del ricercatore, manca l'analisi del microbioma dei pazienti con una diagnosi accertata di CAD (inclusa l'ACS).

Obiettivi:

Lo scopo del presente studio è quello di indagare il microbiota intestinale di pazienti con CAD sintomatica, sia in fase stabile che in fase acuta. I ricercatori ipotizzano che i partecipanti allo studio si presentino con una firma unica del microbioma che potrebbe fornire una nuova visione della fisiopatologia della CAD aterosclerotica, offrendo allo stesso tempo presunte implicazioni terapeutiche.

Dopo aver stabilito la firma unica del microbioma in un'ampia coorte di pazienti con CAD, i ricercatori l'hanno correlata ai livelli di TMAO per indagare ulteriormente sulla sua parte nella fisiopatologia della CAD. Nella fase finale, i ricercatori cercheranno di trovare modi per adattare le opzioni di trattamento personalizzate per modificare il microbiota intestinale "pro-aterosclerotico". Utilizzando i dati dell'attuale studio con la precedente coorte di 1000 pazienti dei ricercatori con microbioma e profilo nutrizionale noti, sarebbe in grado di cercare un obiettivo specifico per l'intervento nutrizionale, come i probiotici. Quindi, i ricercatori monitorerebbero i pazienti con il sequenziamento del microbioma dopo l'intervento nutrizionale.

Metodi:

Progettazione e reclutamento dello studio. I partecipanti allo studio saranno pazienti di età compresa tra 30 e 80 anni che arrivano al Rabin Medical Center con sospetta CAD e in grado di fornire il consenso informato. I partecipanti forniranno questionari medici, sullo stile di vita e nutrizionali. Durante il ricovero verranno effettuate misurazioni della pressione arteriosa e della frequenza cardiaca, nonché esami del sangue e campioni fecali e/o tamponi rettali. Al fine di valutare e/o trattare la sospetta malattia aterosclerotica, i partecipanti saranno sottoposti a TC cardiaca e/o cateterismo cardiaco in accordo con lo standard di cura e in base alla decisione del cardiologo curante. Le opzioni diagnostiche e terapeutiche si baseranno solo sulle condizioni mediche dei partecipanti e indipendentemente dal suddetto protocollo di studio.

Il gruppo di controllo sarà selezionato per rappresentare un gruppo abbinato per età, sesso e fattori di rischio cardiovascolare senza CAD corrente. Ulteriori criteri di esclusione nel gruppo di controllo saranno il consumo di antibiotici nei successivi 3 mesi, la malattia infiammatoria intestinale o altre malattie croniche significative che possono influenzare il microbiota (come il cancro, le malattie autoimmuni e il trattamento immunosoppressivo cronico). Il gruppo di controllo verrà sottoposto a TC cardiaca o angiografia coronarica in base al sospetto clinico al fine di escludere CAD e indipendentemente dal protocollo di studio.

Campioni di sangue. Verranno raccolti 10 ml di sangue venoso in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e gel con tubi contenenti attivatore del coagulo dai pazienti arruolati in tutti i partecipanti allo studio. Le concentrazioni di creatinina sierica, troponina, creatina fosfochinasi (CPK), emoglobina, trigliceridi (TG), colesterolo totale (TC), lipoproteine ​​ad alta densità (HDL), lipoproteine ​​a bassa densità (LDL), glucosio, proteina c-reattiva ( La PCR), il peptide natriuretico di tipo b (BNP) e l'emoglobina A1c (HbA1C) saranno misurati mediante un analizzatore biochimico automatico.

Inoltre, i livelli di TMAO saranno misurati dal plasma sanguigno mediante cromatografia liquida ad altissima prestazione - spettrometria di massa - monitoraggio di reazioni multiple (UHPLC-MS/MRM) come precedentemente descritto.

Profilo nutrizionale. Tutti i partecipanti segnaleranno le loro abitudini di consumo alimentare compilando il Food Frequency Questionnaire (FFQ).

Analisi TC cardiaca. I partecipanti selezionati saranno sottoposti ad angiografia TC per la valutazione e la quantificazione della CAD utilizzando un sistema a 256 strati (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). I dati saranno acquisiti con una collimazione di 96 X 0.625 mm e un tempo di rotazione del gantry di 330 ms. L'iniezione endovenosa di 60-90 ml di mezzo di contrasto non ionico a una velocità di flusso di 5 ml/s sarà seguita da un bolo di inseguimento di soluzione salina da 30 ml (3 ml/s). L'acquisizione verrà eseguita durante un trattenimento del respiro inspiratorio mentre l'elettrocardiogramma verrà registrato simultaneamente per consentire, a seconda della frequenza cardiaca, il gating retrospettivo o prospettico dei dati. Tutte le immagini saranno ricostruite con uno spessore dello strato di 0,67 mm e un incremento dello strato di 0,34 mm. Il set di dati completo verrà trasmesso a una workstation CT dedicata con uno strumento di ricostruzione tridimensionale specificamente progettato per l'angiografia coronarica (Philips Intellispace Portal, versione 7.0) per consentire le riformazioni multiplanari e l'analisi quantitativa della placca. Un lettore indipendente esaminerà tutti gli studi. Ogni vaso contenente una stenosi significativa sarà analizzato in immagini riformattate multiplanari curve in viste dell'asse lungo e della sezione trasversale. Verranno misurati i diametri nel sito di massima stenosi e nei riferimenti prossimale e distale. Il grado di stenosi sarà calcolato come rapporto tra la differenza tra il diametro alla massima stenosi e la media dei diametri ai riferimenti prossimale e distale divisa per la media dei diametri ai riferimenti prossimale e distale ed espressa in percentuale. L'indice di rimodellamento sarà calcolato come l'area esterna del vaso nel sito di massima stenosi divisa per la media delle aree esterne del vaso ai riferimenti prossimale e distale. Il rimodellamento positivo sarà definito come un indice di rimodellamento ≥ 1,05. Il volume della placca verrà calcolato automaticamente come il volume di tutti i voxel segmentati tra i confini luminali ed esterni del vaso su immagini riformattate multiplanari curve. I riferimenti prossimali e distali verranno utilizzati come estremità prossimale e distale delle placche. Gli investigatori riporteranno il volume totale della placca e i volumi dei sottotipi di placca: placche calcificate, non calcificate e miste.

Cateterizzazione cardiaca e intervento coronarico percutaneo (PCI). I pazienti saranno ammessi al laboratorio di cateterizzazione in base alla loro presentazione clinica, tenendo conto delle attuali linee guida cliniche ESC/AHA. La procedura di cateterizzazione cardiaca verrà eseguita utilizzando tecniche percutanee standard attraverso l'arteria radiale o femorale. Le lesioni coronariche saranno valutate dall'operatore in termini di stenosi mediante stima visiva o altro utilizzando misurazioni oggettive, come l'analisi coronarica quantitativa (QCA). L'intervento coronarico, inclusa l'angioplastica con palloncino e l'impianto di stent, sarà implementato secondo necessità e in base alla gravità della stenosi coronarica, ovvero (stenosi del diametro ≥70%). L'imaging coronarico aggiuntivo (OCT o ecografia intravascolare) verrà eseguito a discrezione dell'operatore e indipendentemente dal protocollo dello studio. Tutti i pazienti saranno trattati durante la procedura con anticoagulanti (principalmente eparina non frazionata) utilizzando un attento monitoraggio del tempo di coagulazione attivato tra 250-300 secondi. Dopo la procedura di angioplastica, tutti i pazienti saranno trattati con doppia terapia antiaggregante piastrinica combinando aspirina e inibitore P2Y12 (clopidogrel, prasugrel o ticagrelor, secondo l'indicazione clinica) per 6-12 mesi, a meno che non vi siano controindicazioni, come trattamento con anticoagulanti orali.

Estrazione e filtraggio del DNA genomico. Il DNA genomico dei campioni di feci sarà purificato utilizzando il kit di isolamento del DNA del suolo PowerMag (MoBio) ottimizzato per la piattaforma automatizzata Tecan. Per il sequenziamento shotgun, 100 ng di DNA purificato saranno tagliati con un sonicatore Covaris E220X.

Analisi del microbioma. I campioni di microbioma saranno elaborati da una pipeline robotica automatizzata in formato a 96 pozzetti. Ogni gruppo di campioni raccolti sarà processato roboticamente sia per il 16S che per il sequenziamento metagenomico.

Generazione di funzionalità basate sul microbioma. I ricercatori impiegheranno ed estenderanno ulteriormente una pipeline computazionale che è stata sviluppata per generare un ricco set di caratteristiche da un campione metagenomico. Queste caratteristiche saranno la base per i modelli che identificano le firme basate sul microbioma.

Abbondanza batteriche e virali: mappatura del campione del metagenoma su un database del genoma batterico di riferimento, quindi conteggio del numero di letture mappate su ciascun batterio, risultante in un vettore di abbondanze batteriche relative per ciascun campione.

Diversità batterica - Utilizzando le relative abbondanze batteriche derivate sopra, i ricercatori calcoleranno diverse misure della diversità di batteri e virus in un campione di metagenoma (ad esempio, entropia di Shannon del vettore di abbondanza relativa, numero di batteri al di sopra di un livello minimo di abbondanza), come è stato dimostrato che la diversità del campione è associata a determinati aspetti fisiologici dell'ospite come l'adiposità generale e la resistenza all'insulina.

Tassi di crescita batterica - Per ogni campione di metagenoma, i ricercatori calcoleranno un vettore che corrisponde al tasso di crescita di ciascun batterio nel campione, utilizzando un nuovo metodo recentemente sviluppato per questo scopo. In breve, esaminando il modello di copertura della lettura del sequenziamento (profondità) lungo la lunghezza di diversi genomi batterici, i ricercatori hanno scoperto che molti batteri mostrano un modello di copertura prototipico, costituito da un singolo solco e un singolo picco. In particolare, la posizione del picco coincide con l'origine nota della replicazione dei batteri, suggerendo che la copertura di lettura aggiunta vicino al picco rappresenta il DNA appena replicato. Per ogni dato batterio, il rapporto tra la copertura del picco e della depressione varia notevolmente tra i campioni di diversi microbiomi intestinali umani, con rapporti elevati simili a quelli ottenuti durante la fase di crescita esponenziale dei batteri cresciuti in coltura e rapporti bassi simili alla crescita in stazionario fase.

Abbondanza genica - Gli investigatori calcoleranno le abbondanze relative dei geni nei campioni di metagenoma applicando un approccio simile a quello sopra per derivare le abbondanze relative dei batteri. A tal fine, invece di mappare le letture al database del genoma batterico di riferimento, i ricercatori le mapperanno a un database di riferimento di geni batterici che è stato recentemente esteso e che contiene collettivamente oltre 3 milioni di geni batterici distinti. I vettori di abbondanza genica derivati ​​sono complementari ai vettori di abbondanza batterica, con il vantaggio di essere mappati su geni il cui genoma batterico incorporato è sconosciuto e quindi consentendo di mappare più letture di sequenziamento del metagenoma e con lo svantaggio di produrre un vettore di caratteristiche molto più grande.

Abbondanza del percorso biologico - Come un'altra serie di caratteristiche che forniscono informazioni a livello funzionale del microbiota, i ricercatori utilizzeranno il database KEGG dei percorsi biologici51 e il suddetto vettore dell'abbondanza genica di ciascun campione per calcolare un punteggio di abbondanza per ciascun percorso biologico. Il vantaggio chiave di questo insieme di caratteristiche è che le sue associazioni forniscono ipotesi dirette sui meccanismi sottostanti attraverso i quali il microbiota può essere coinvolto con il fenotipo correlato.

Conservazione dei campioni. I campioni così come il DNA rimanente ei sieri congelati saranno conservati in congelatori a -80°C. Anche i campioni di feci non processati (ad esempio, non tutti i campioni raccolti annualmente verranno processati inizialmente) verranno conservati in congelatori a -80°C.

Analisi statistica. Dati clinici come segni vitali, fattori di rischio cardiovascolare (età, sesso, profilo lipidico, indice glicemico, abitudine al fumo, pregressa CAD), comorbilità croniche, uso regolare di farmaci, risultati di imaging alla TC cardiaca e/o al cateterismo cardiaco, nonché i livelli degli enzimi cardiaci saranno raccolti presso il Rabin Medical Center. Al Weizmann Institute of Science, nel dipartimento di informatica del Segal Lab, gli investigatori analizzeranno i dati. Per ciascun parametro verrà eseguita un'analisi di associazione per identificare tutti i parametri del microbioma associati a questi parametri clinici.

Dopo aver analizzato le firme del microbioma in quei pazienti, dove noti interventi probiotici e/o nutrizionali possono portare al cambiamento desiderato, i ricercatori interverranno e quindi monitoreranno con il sequenziamento del microbioma dopo l'intervento.