ヒトの腸内マイクロバイオームは冠動脈アテローム性動脈硬化症の新しい個別化治療標的として機能するか?

序章：

人間の胃腸系には、さまざまな共生微生物、すなわち微生物叢が生息しています。 総重量は約2キログラムで、そこには数兆個の微生物が含まれています。 マイクロバイオームは、微生物叢の全遺伝的 (メタゲノム) データです。 近年、ゲノム配列決定とバイオインフォマティクスの効率的な方法の開発により、マイクロバイオームの迅速かつ正確な定量化と認定が可能になり、マイクロバイオーム分析は微生物叢研究の主要な方法となっています。

冠動脈疾患（CAD）は、世界中で年間 800 万人以上の死者を出しています。 特に、急性冠症候群（ACS）は依然として罹患率と死亡率の主な原因であり、米国では年間 100 万人以上が入院しています。 ACS の病態生理学的特徴は、アテローム性動脈硬化性プラーク損傷によって引き起こされる冠状動脈血栓症であり、2 種類の損傷が報告されています。 1つ目はプラーク破裂であり、これは依然として冠状動脈アテローム血栓症の最も一般的な原因であり、2つ目は表面プラークびらんであり、ますます頻繁に認識されています。 プラークの破裂とは対照的に、びらんによって引き起こされる病変には、薄い線維性キャップ、豊富な炎症細胞、または大きな脂質コアはなく、むしろプロテオグリカンやグリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスが豊富に含まれています。

不安定/脆弱なアテローム性動脈硬化性プラークの原因となるメカニズムを特徴付けるために、冠動脈コンピュータ断層撮影血管造影 (CCTA) や光干渉断層撮影 (OCT) の有無にかかわらず診断用冠動脈カテーテル法などの画像検査が臨床現場でますます使用されています。

ヒトの腸内細菌叢は、基質の代謝交換および共代謝を通じて宿主と広範囲に相互作用します。それにより、人体のさまざまな代謝および免疫学的メカニズムに貢献します。 CAD は微生物叢研究において注目されている主要分野であり、腸内微生物叢と CAD の病態生理学を関連付けるいくつかの発見があります。 まず、微生物叢はメタボリックシンドローム、つまり肥満やインスリン抵抗性と関連していました。 腸内微生物叢によって短鎖脂肪酸が増加し、最終的に食欲が増して肥満が引き起こされるのではないかという仮説が立てられています。 別の仮説は、腸内微生物叢の内毒素が血流に移行し、最終的にアテローム性動脈硬化を促進する炎症カスケードを誘発する可能性があるというものです。 第二に、微生物叢もアテローム性動脈硬化症の発症に関与している可能性があります。 症候性アテローム性動脈硬化症の患者には、炎症促進性の特徴を持つ可能性のある独特のマイクロバイオーム パターンが存在します。 最近、心血管リスクプロファイルが高い患者の間で、独特の微生物パターンが発見されました。 第三に、腸内微生物叢は食事性ホスファチジルコリン (レシチン) を代謝して、心血管イベントのリスク増加と関連する代謝産物であるトリメチルアミン-N-オキシド (TMAO) を生成します。

これまでに発表されたデータは、ヒトの腸内マイクロバイオームと心血管の危険因子の間の相互作用のみに関するものです。 研究者の知識と理解の限りでは、CAD (ACS を含む) の診断が確立されている患者のマイクロバイオーム分析は不足しています。

目的:

現在の研究の目的は、安定期と急性期の両方の症候性 CAD 患者の腸内細菌叢を調査することです。 研究者らは、研究参加者はアテローム性動脈硬化性 CAD の病態生理学への新たな洞察を提供すると同時に、推定上の治療的意義を与える可能性がある独自のマイクロバイオーム シグネチャを提示するだろうと仮説を立てています。

CAD患者の大規模コホートにおいて固有のマイクロバイオームの特徴を確立した後、研究者らはそれをTMAOレベルと相関させて、CADの病態生理学におけるマイクロバイオームの役割をさらに調査することになる。 最終段階では、研究者らは、「アテローム性動脈硬化促進性」の腸内細菌叢を変化させるために、個別の治療オプションを調整する方法を見つけようとするだろう。 既知のマイクロバイオームと栄養プロファイルを持つ研究者らの以前の1000人の患者コホートを対象とした現在の研究のデータを使用することで、プロバイオティクスなどの栄養介入の特定のターゲットを検索できる可能性がある。 その後、研究者らは栄養介入後にマイクロバイオームの配列を決定して患者を監視することになる。

方法:

研究の設計と採用。 研究の参加者は、CADの疑いでラビン医療センターに来院し、インフォームドコンセントを提供できる30～80歳の患者となります。 参加者は医学的、ライフスタイル、栄養に関するアンケートを提出します。 入院中に血圧と心拍数の測定が行われるほか、血液検査、糞便サンプルおよび/または直腸スワブも検査されます。 アテローム性動脈硬化症の疑いを評価および/または治療するために、参加者は標準治療に従って、治療する心臓専門医の決定に基づいて心臓 CT および/または心臓カテーテル検査を受けます。 診断と治療の選択肢は、前述の研究プロトコルに関係なく、参加者の病状のみに基づいて決定されます。

対照群は、年齢、性別、心臓血管の危険因子が一致し、現在 CAD を持たないグループを代表するように選択されます。 対照群におけるさらなる除外基準は、その後 3 か月以内の抗生物質の摂取、炎症性腸疾患、または微生物叢に影響を与える可能性のあるその他の重大な慢性疾患 (癌、自己免疫疾患、慢性免疫抑制治療など) です。 対照群は、臨床的疑いに応じて、CADを除外するために、研究プロトコールに関係なく、心臓CTまたは冠動脈造影検査を受ける。

血液サンプル。 研究参加者全員の登録患者から、10 ml の静脈血をエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) に採取し、凝固活性化剤を含むチューブでゲル化します。 血清クレアチニン、トロポニン、クレアチンホスホキナーゼ（CPK）、ヘモグロビン、トリグリセリド（TG）、総コレステロール（TC）、高密度リポタンパク質（HDL）、低密度リポタンパク質（LDL）、グルコース、C反応性タンパク質（ CRP）、b型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、ヘモグロビンA1c（HbA1C）を自動生化学分析装置で測定します。

さらに、TMAO のレベルは、前述のように超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析 - 多重反応モニタリング (UHPLC-MS/MRM) を使用して血漿から測定されます。

栄養プロファイリング。 すべての参加者は、食事頻度アンケート (FFQ) に記入して、食事の摂取習慣を報告します。

心臓CT分析。 選ばれた参加者は、256 スライス システム (Brilliance iCT、Philips Healthcare、クリーブランド、オハイオ州) を使用して CAD の評価と定量化のために CT 血管造影検査を受けます。 データは、96 X 0.625 mm のコリメーションと 330 ms のガントリー回転時間で取得されます。 流速 5 ml/秒での 60 ～ 90 ml の非イオン性造影剤の静脈内注射に続いて、30 ml の生理食塩水チェイス ボーラス (3 ml/秒) が続きます。 取得は吸気息止め中に実行され、同時に心電図が記録され、心拍数に応じてデータの遡及的または前向きのゲートが可能になります。 すべての画像は、スライス厚 0.67 mm、スライス増分 0.34 mm で再構成されます。 完全なデータセットは、冠状動脈造影用に特別に設計された 3 次元再構成ツール (Philips Intellispace Portal、バージョン 7.0) を備えた専用 CT ワークステーションに送信され、多面再構成と定量的プラーク分析が可能になります。 独立した読者がすべての研究をレビューします。 重大な狭窄を含む各血管は、長軸および断面図の曲面多平面再フォーマット画像で分析されます。 最大狭窄部位および近位基準および遠位基準における直径が測定されます。 狭窄の程度は、最大狭窄における直径と近位および遠位基準の直径の平均との差の比を近位および遠位基準の直径の平均で割った比率として計算され、パーセンテージで表されます。 リモデリングインデックスは、最大狭窄部位の外血管面積を近位基準および遠位基準における外血管面積の平均で割ったものとして計算されます。 陽性リモデリングは、リモデリング指数 ≥ 1.05 として定義されます。 プラークの体積は、湾曲した多平面再フォーマット画像上の管腔境界と外血管境界の間でセグメント化されたすべてのボクセルの体積として自動的に計算されます。 近位および遠位の参照は、プラークの近位端および遠位端として使用されます。 研究者は、プラークの総体積と、石灰化プラーク、非石灰化プラーク、および混合プラークといったプラークのサブタイプの体積を報告します。

心臓カテーテル検査と経皮的冠動脈インターベンション (PCI)。 患者は、現在の ESC/AHA 臨床ガイドラインを考慮して、臨床症状に応じてカテーテル検査室に入院します。 心臓カテーテル法は、橈骨動脈または大腿動脈を介して標準的な経皮的手法を使用して行われます。 冠状動脈病変は、オペレーターによって視覚的評価によって、または定量的冠状動脈分析 (QCA) などの客観的な測定を使用して、狭窄の観点から評価されます。 バルーン血管形成術やステント移植などの冠動脈インターベンションは、冠動脈狭窄の重症度（直径 70% 以上の狭窄）に応じて、必要に応じて実施されます。 補助的な冠動脈イメージング (OCT または血管内超音波) は、研究プロトコルに関係なく、オペレーターの裁量に従って実行されます。 すべての患者は、250～300秒間の活性化凝固時間を注意深く監視しながら、処置中に抗凝固療法（主に未分画ヘパリン）で治療されます。 血管形成術後、すべての患者は、以下のような禁忌がない限り、アスピリンとP2Y12阻害剤（臨床適応に応じてクロピドグレル、プラスグレルまたはチカグレロル）を組み合わせた二重抗血小板療法で6〜12か月間治療されます。経口抗凝固剤による治療。

ゲノム DNA の抽出とフィルタリング。 便サンプルからのゲノム DNA は、Tecan 自動プラットフォーム用に最適化された PowerMag Soil DNA 分離キット (MoBio) を使用して精製されます。 ショットガンシークエンシングの場合、100 ng の精製 DNA を Covaris E220X 超音波処理装置で断片化します。

マイクロバイオーム分析。 マイクロバイオームのサンプルは、96 ウェル形式の自動ロボット パイプラインによって処理されます。 収集された各サンプルグループは、16S シーケンスとメタゲノムシーケンスの両方のためにロボット処理されます。

マイクロバイオームベースの特徴の生成。 研究者らは、メタゲノムサンプルから豊富な特徴セットを生成するために開発された計算パイプラインを採用し、さらに拡張する予定です。 これらの特徴は、マイクロバイオームベースのシグネチャーを識別するモデルの基礎となります。

細菌およびウイルスの存在量 - メタゲノム サンプルを参照細菌ゲノム データベースにマッピングし、各細菌にマッピングされた読み取り数をカウントします。これにより、各サンプルの相対的な細菌存在量のベクトルが得られます。

細菌の多様性 - 上記で導出された相対的な細菌存在量を使用して、研究者は、メタゲノム サンプル中の細菌とウイルスの多様性のいくつかの尺度 (例: 相対存在量ベクトルのシャノン エントロピー、最小存在量レベルを超える細菌の数) を計算します。サンプルの多様性は、全体的な肥満やインスリン抵抗性など、宿主の特定の生理学的側面と関連していることが示されています。

細菌の増殖速度 - 研究者は、メタゲノム サンプルごとに、この目的のために最近開発された新しい方法を使用して、サンプル内の各細菌の増殖速度に対応するベクトルを計算します。 簡単に言うと、研究者らは、さまざまな細菌ゲノムの長さにわたるシーケンシングリードのカバレッジ（深さ）のパターンを調べることによって、多くの細菌が単一の谷と単一のピークからなる典型的なカバレッジパターンを示すことを発見しました。 特に、ピークの位置は細菌の既知の複製起点と一致しており、ピーク付近に追加されたリード カバレッジが新たに複製された DNA を表すことを示唆しています。 どの細菌についても、ピークとトラフの範囲の比率は、異なるヒト腸内微生物叢のサンプル間で大きく異なり、高い比率は培養下で増殖した細菌の指数関数的増殖期に得られるものと同様であり、低い比率は静置環境での増殖と同様です。段階。

遺伝子存在量 - 研究者は、細菌の相対存在量を導き出すための上記のアプローチと同様のアプローチを適用することにより、メタゲノムサンプル中の遺伝子の相対存在量を計算します。 この目的を達成するために、研究者らは、リードを参照細菌ゲノム データベースにマッピングするのではなく、最近拡張され、集合的に 300 万を超える異なる細菌遺伝子を含む細菌遺伝子の参照データベースにリードをマッピングします。 派生遺伝子存在量ベクターは細菌存在量ベクターと相補的であり、その利点は、埋め込まれている細菌ゲノムが不明な遺伝子にマッピングできるため、より多くのメタゲノム シーケンシング リードをマッピングできることですが、欠点は、はるかに大きな特徴ベクトルを生成することです。

生物学的経路の存在量 - 微生物叢の機能レベルでの情報を提供する別の一連の特徴として、研究者らは、生物学的経路の KEGG データベース 51 と各サンプルの遺伝子存在量の上記のベクトルを使用して、各生物学的経路の存在量スコアを計算します。 この一連の特徴の主な利点は、その関連性により、微生物叢が相関する表現型に関与する可能性がある根底にあるメカニズムに関する直接的な仮説が提供されることです。

サンプル保管庫。 サンプルと残りの DNA および凍結血清は -80℃ の冷凍庫に保管されます。 未処理の便サンプル（例えば、毎年収集されるすべてのサンプルが最初に処理されるわけではない）も、-800℃の冷凍庫に保管されます。

統計分析。 バイタルサイン、心血管危険因子（年齢、性別、脂質プロファイル、血糖指数、喫煙状況、以前のCAD）、慢性併存疾患、定期的な薬物使用、心臓CTおよび/または心臓カテーテル検査の画像所見などの臨床データ。心筋酵素レベルはラビン医療センターで収集されます。 ワイツマン科学研究所のコンピュータ サイエンス部門、シーガル研究所の研究員がデータを分析します。 各パラメーターについて関連性分析が実行され、これらの臨床パラメーターに関連するすべてのマイクロバイオーム パラメーターが特定されます。

それらの患者のマイクロバイオームの特徴を分析した後、既知のプロバイオティクスおよび/または栄養介入が望ましい変化をもたらす可能性がある場合、研究者は介入し、介入後のマイクロバイオームの配列を監視します。