¿Sirve el microbioma intestinal humano como un nuevo objetivo terapéutico personalizado para la aterosclerosis coronaria?

Introducción:

El sistema gastrointestinal humano está poblado por una variedad de microorganismos simbióticos, a saber, la microbiota. Su peso total es de aproximadamente 2 kilogramos y contiene billones de microorganismos. El microbioma es el conjunto de datos genéticos (metagenómicos) de la microbiota. En los últimos años, el desarrollo de métodos eficientes para la secuenciación del genoma y la bioinformática ha permitido una cuantificación y cualificación rápidas y precisas del microbioma, lo que ha convertido al análisis del microbioma en el método líder de investigación de la microbiota.

La enfermedad de las arterias coronarias (CAD) representó más de 8 millones de muertes anuales en todo el mundo. En particular, el síndrome coronario agudo (ACS) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad y es responsable de más de 1 millón de ingresos hospitalarios en los Estados Unidos anualmente. El sello fisiopatológico del SCA es la trombosis coronaria causada por una lesión de la placa aterosclerótica, describiéndose dos tipos de lesiones. El primero es la ruptura de la placa, que sigue siendo la causa más frecuente de aterotrombosis coronaria, y el segundo es la erosión superficial de la placa, que se reconoce cada vez con mayor frecuencia. A diferencia de la ruptura de la placa, las lesiones causadas por la erosión no tienen capas fibrosas delgadas, células inflamatorias abundantes o un núcleo lipídico grande, sino que son ricas en matriz extracelular, como proteoglicanos y glicosaminoglicanos.

Los estudios de imagen como la angiografía por tomografía computarizada coronaria (CCTA) y los cateterismos coronarios de diagnóstico con o sin tomografía de coherencia óptica (OCT) se utilizan cada vez más en la práctica clínica para caracterizar el mecanismo responsable de la placa aterosclerótica inestable/vulnerable.

La microbiota intestinal humana interactúa ampliamente con el huésped a través del intercambio metabólico y el cometabolismo de sustratos; contribuyendo así a una variedad de mecanismos metabólicos e inmunológicos en el cuerpo humano. La CAD es un campo de gran interés en la investigación de la microbiota y ha habido varios hallazgos que conectan la microbiota intestinal con la fisiopatología de la CAD. Primero, la microbiota se asoció con el síndrome metabólico, a saber, la obesidad y la resistencia a la insulina. Se plantea la hipótesis de que la microbiota intestinal puede aumentar los ácidos grasos de cadena corta, que eventualmente aumentan el apetito y, por lo tanto, causan obesidad. Otra hipótesis es que las endotoxinas de la microbiota intestinal pueden translocarse al torrente sanguíneo, provocando una cascada inflamatoria que eventualmente promueve la aterosclerosis. En segundo lugar, la microbiota también puede desempeñar un papel en el desarrollo de la aterosclerosis. En pacientes con aterosclerosis sintomática, existe un patrón de microbioma único que puede tener características proinflamatorias. Recientemente, se encontró un patrón microbiano único entre pacientes con alto perfil de riesgo cardiovascular. En tercer lugar, la microbiota intestinal metaboliza la fosfatidilcolina de la dieta (lecitina) para producir el metabolito trimetilamina-N-óxido (TMAO), que se asocia con un mayor riesgo de eventos cardiovasculares.

Los datos publicados hasta ahora se relacionan únicamente con la interacción entre el microbioma intestinal humano y los factores de riesgo cardiovascular. Según el conocimiento y la comprensión del investigador, falta el análisis del microbioma de los pacientes con un diagnóstico establecido de CAD (incluido el SCA).

Objetivos:

El propósito del presente estudio es investigar la microbiota intestinal de pacientes con CAD sintomática, tanto en fase estable como aguda. Los investigadores plantean la hipótesis de que los participantes del estudio presentarían una firma de microbioma única que puede proporcionar una visión novedosa de la fisiopatología de la CAD aterosclerótica al tiempo que ofrece implicaciones terapéuticas putativas.

Después de establecer la firma única del microbioma en una gran cohorte de pacientes con CAD, los investigadores la correlacionarían con los niveles de TMAO para investigar más a fondo su papel en la fisiopatología de la CAD. En la etapa final, los investigadores tratarían de encontrar formas de ajustar las opciones de tratamiento personalizado para cambiar la microbiota intestinal "proaterosclerótica". Mediante el uso de datos del estudio actual con la cohorte anterior de 1000 pacientes de los investigadores con microbioma y perfil nutricional conocidos, podría buscar un objetivo específico para la intervención nutricional, como los probióticos. Luego, los investigadores monitorearían a los pacientes con la secuenciación del microbioma después de la intervención nutricional.

Métodos:

Diseño de estudios y reclutamiento. Los participantes del estudio serán pacientes de entre 30 y 80 años que lleguen al Centro Médico Rabin con sospecha de CAD y que puedan dar su consentimiento informado. Los participantes proporcionarán cuestionarios médicos, de estilo de vida y nutricionales. Se tomarán medidas de presión arterial y frecuencia cardíaca durante la hospitalización, así como análisis de sangre y muestras de heces y/o hisopos rectales. Con el fin de evaluar y/o tratar la posible enfermedad aterosclerótica, los participantes se someterán a una TC cardíaca y/o un cateterismo cardíaco de acuerdo con el estándar de atención y según la decisión del cardiólogo tratante. Las opciones de diagnóstico y tratamiento se basarán únicamente en la condición médica de los participantes e independientemente del protocolo del estudio antes mencionado.

El grupo de control se seleccionará para representar un grupo emparejado por edad, sexo y factores de riesgo cardiovascular sin CAD actual. Otros criterios de exclusión en el grupo control serán el consumo de antibióticos en los siguientes 3 meses, enfermedad inflamatoria intestinal u otra enfermedad crónica significativa que pueda influir en la microbiota (como cáncer, enfermedad autoinmune y tratamiento inmunosupresor crónico). Al grupo control se le realizará una TC cardíaca o una coronariografía según la sospecha clínica para descartar EAC e independientemente del protocolo de estudio.

Muestras de sangre. Se recolectarán 10 ml de sangre venosa en tubos que contienen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y gel con activador de coágulos de los pacientes inscritos en todos los participantes del estudio. Las concentraciones séricas de creatinina, troponina, creatina fosfocinasa (CPK), hemoglobina, triglicéridos (TG), colesterol total (TC), lipoproteínas de alta densidad (HDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL), glucosa, proteína c reactiva ( La PCR), el péptido natriurético tipo b (BNP) y la hemoglobina A1c (HbA1C) se medirán mediante un analizador bioquímico automático.

Además, los niveles de TMAO se medirán a partir del plasma sanguíneo mediante cromatografía líquida de rendimiento ultraalto, espectrometría de masas, monitorización de reacciones múltiples (UHPLC-MS/MRM) como se describió anteriormente.

Perfil nutricional. Todos los participantes reportarán sus hábitos de consumo de alimentos mediante el llenado del Cuestionario de Frecuencia de Alimentos (FFQ).

Análisis de TC cardíaco. Los participantes seleccionados se someterán a una angiografía por TC para la evaluación y cuantificación de la EAC mediante un sistema de 256 cortes (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Los datos se adquirirán con una colimación de 96 X 0,625 mm y un tiempo de rotación del gantry de 330 ms. La inyección intravenosa de 60 a 90 ml de agente de contraste no iónico a una velocidad de flujo de 5 ml/s será seguida por un bolo de seguimiento de solución salina de 30 ml (3 ml/s). La adquisición se realizará durante una contención de la respiración inspiratoria mientras que el electrocardiograma se registrará simultáneamente para permitir, en función de la frecuencia cardíaca, la sincronización retrospectiva o prospectiva de los datos. Todas las imágenes se reconstruirán con un grosor de corte de 0,67 mm y un incremento de corte de 0,34 mm. El conjunto de datos completo se transmitirá a una estación de trabajo de TC dedicada con una herramienta de reconstrucción tridimensional diseñada específicamente para angiografía coronaria (Philips Intellispace Portal, versión 7.0) para permitir reformaciones multiplanares y análisis cuantitativo de placa. Un lector independiente revisará todos los estudios. Cada vaso que contenga estenosis significativa se analizará en imágenes reformateadas multiplanares curvas en vistas de eje largo y transversales. Se medirán los diámetros en el sitio de máxima estenosis y en las referencias proximal y distal. El grado de estenosis se calculará como el cociente de la diferencia entre el diámetro en la estenosis máxima y la media de los diámetros en las referencias proximal y distal dividido por la media de los diámetros en las referencias proximal y distal y expresado como porcentaje. El índice de remodelación se calculará como el área del vaso externo en el sitio de máxima estenosis dividida por la media de las áreas del vaso externo en las referencias proximal y distal. El remodelado positivo se definirá como un índice de remodelado ≥ 1,05. El volumen de la placa se calculará automáticamente como el volumen de todos los vóxeles segmentados entre los límites luminal y exterior del vaso en imágenes reformateadas multiplanares curvas. Las referencias proximal y distal se utilizarán como extremos proximal y distal de las placas. Los investigadores informarán el volumen total de placa y los volúmenes de los subtipos de placa: placas calcificadas, no calcificadas y mixtas.

Cateterismo cardíaco e intervención coronaria percutánea (ICP). Los pacientes serán admitidos en el laboratorio de cateterismo de acuerdo a su presentación clínica, teniendo en cuenta las guías clínicas ESC/AHA vigentes. El procedimiento de cateterismo cardíaco se realizará utilizando técnicas percutáneas estándar a través de la arteria radial o femoral. Las lesiones coronarias serán evaluadas por el operador en términos de estenosis por estimación visual u otro uso de medidas objetivas, como el análisis coronario cuantitativo (QCA). La intervención coronaria, incluida la angioplastia con balón y la implantación de stent, se implementará según sea necesario y de acuerdo con la gravedad de la estenosis coronaria, es decir, (≥70 % de diámetro de estenosis). Se realizarán imágenes coronarias complementarias (OCT o ultrasonido intravascular) según el criterio del operador e independientemente del protocolo del estudio. Todos los pacientes serán tratados durante el procedimiento con anticoagulación (principalmente heparina no fraccionada) mediante un control cuidadoso del tiempo de coagulación activado entre 250 y 300 segundos. Tras el procedimiento de angioplastia, todos los pacientes serán tratados con terapia antiplaquetaria dual combinando aspirina e inhibidor de P2Y12 (clopidogrel, prasugrel o ticagrelor, según la indicación clínica) durante 6-12 meses, salvo que exista contraindicación, como tratamiento con anticoagulantes orales.

Extracción y filtrado de ADN genómico. El ADN genómico de las muestras de heces se purificará con el kit de aislamiento de ADN del suelo PowerMag (MoBio) optimizado para la plataforma automatizada Tecan. Para la secuenciación rápida, se cortarán 100 ng de ADN purificado con un sonicador Covaris E220X.

Análisis de microbioma. Las muestras de microbioma serán procesadas por una tubería robótica automatizada en formato de 96 pocillos. Cada grupo de muestra recolectado se procesará robóticamente para la secuenciación 16S y metagenómica.

Generación de características basadas en microbiomas. Los investigadores emplearán y ampliarán aún más una tubería computacional que se desarrolló para generar un conjunto rico de características a partir de una muestra metagenómica. Estas características serán la base para modelos que identifiquen firmas basadas en microbiomas.

Abundancias bacterianas y virales: asignación de la muestra del metagenoma a una base de datos del genoma bacteriano de referencia y, a continuación, recuento del número de lecturas asignadas a cada bacteria, lo que da como resultado un vector de abundancias bacterianas relativas para cada muestra.

Diversidad bacteriana: utilizando las abundancias bacterianas relativas derivadas anteriormente, los investigadores calcularán varias medidas de la diversidad de bacterias y virus en una muestra de metagenoma (por ejemplo, la entropía de Shannon del vector de abundancia relativa, el número de bacterias por encima de un nivel mínimo de abundancia), como Se demostró que la diversidad de muestras estaba asociada con ciertos aspectos fisiológicos del huésped, como la adiposidad general y la resistencia a la insulina.

Tasas de crecimiento bacteriano: para cada muestra de metagenoma, los investigadores calcularán un vector que corresponde a la tasa de crecimiento de cada bacteria en la muestra, utilizando un método novedoso que se desarrolló recientemente para este propósito. Brevemente, al examinar el patrón de cobertura de lectura de secuenciación (profundidad) a lo largo de diferentes genomas bacterianos, los investigadores encontraron que muchas bacterias exhiben un patrón de cobertura prototípico, que consiste en un solo canal y un solo pico. En particular, la ubicación del pico coincide con el origen de replicación conocido de la bacteria, lo que sugiere que la cobertura de lectura agregada cerca del pico representa el ADN recién replicado. Para cualquier bacteria dada, la proporción entre la cobertura máxima y mínima varía mucho entre las muestras de diferentes microbiomas intestinales humanos, con proporciones altas similares a las obtenidas durante la fase de crecimiento exponencial de bacterias cultivadas en cultivo, y proporciones bajas similares al crecimiento en estacionario. fase.

Abundancias de genes: los investigadores calcularán las abundancias relativas de genes en muestras de metagenomas aplicando un enfoque similar al anterior para derivar abundancias relativas de bacterias. Con este fin, en lugar de asignar las lecturas a la base de datos del genoma bacteriano de referencia, los investigadores las asignarán a una base de datos de referencia de genes bacterianos que se amplió recientemente y que, en conjunto, contiene más de 3 millones de genes bacterianos distintos. Los vectores de abundancia de genes derivados son complementarios a los vectores de abundancia de bacterias, con la ventaja de mapear genes cuyo genoma bacteriano incorporado es desconocido y, por lo tanto, permitir mapear más lecturas de secuenciación de metagenomas, y con la desventaja de producir un vector de características mucho más grande.

Abundancias de vías biológicas: como otro conjunto de características que proporcionan información a nivel funcional de la microbiota, los investigadores utilizarán la base de datos KEGG de vías biológicas51 y el vector anterior de abundancia de genes de cada muestra para calcular una puntuación de abundancia para cada vía biológica. La ventaja clave de este conjunto de características es que sus asociaciones proporcionan hipótesis directas sobre los mecanismos subyacentes a través de los cuales la microbiota puede estar involucrada con el fenotipo correlacionado.

Almacenamiento de muestras. Las muestras, así como el ADN restante y los sueros congelados, se almacenarán en congeladores a -80 °C. Las muestras de heces no procesadas (p. ej., no todas las muestras recolectadas anualmente se procesarán inicialmente) también se almacenarán en congeladores a -800 °C.

Análisis estadístico. Datos clínicos como signos vitales, factores de riesgo cardiovascular (edad, sexo, perfil de lípidos, índice glucémico, tabaquismo, CAD anterior), comorbilidades crónicas, uso regular de drogas, hallazgos de imágenes en TC cardíaca y/o cateterismo cardíaco, así como los niveles de enzimas cardíacas se recogerán en el Centro Médico Rabin. En el instituto de ciencias Weizmann, en el departamento de informática del laboratorio Segal, los investigadores analizarán los datos. Para cada parámetro, se realizarán análisis de asociación para identificar todos los parámetros del microbioma que están asociados con estos parámetros clínicos.

Después de analizar las firmas del microbioma en esos pacientes, donde las intervenciones probióticas y/o nutricionales conocidas pueden conducir al cambio deseado, los investigadores intervendrán y luego monitorearán con la secuenciación del microbioma después de la intervención.